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- まず、組織培養培地を含むTフラスコに肺がん細胞を播種し、一晩成長させます。次に、トランスフェクション剤を含むmiRNAをトランスフェクション培地に懸濁します。培地を取り出し、がん細胞にmiRNAを導入するトランスフェクション培地を追加します。miRNAは、相補的なmRNA配列に結合し、遺伝子発現をブロックするノンコーディングRNA分子です。フラスコを希望の期間インキュベートします。
次に、培地を組織培養培地に交換し、一晩で成長させます。細胞解離のためにトリプシンを添加します。混合物をPBSの入った遠心分離管に移し、遠心分離します。上清を取り除き、溶解バッファーを溶解細胞に添加し、超高純度エタノールを添加して沈殿させます。混合物を分離カラムに入れて核酸を精製し、遠心分離します。
フロースルーを取り出し、洗浄バッファーを添加して溶解した細胞膜を除去し、遠心分離します。洗浄バッファーを取り出し、DNaseとDNase消化バッファーを添加してサンプルからDNAを除去し、遠心分離します。RNA調製バッファーを添加してRNAを単離し、遠心分離します。上清中に存在するRNAを採取します。以下のプロトコールでは、miRNAで治療した肺がん細胞からRNA抽出を行います。
- まず、qPCRまたはマイクロアレイ解析を使用して遺伝子発現を行うためのRNAおよびタンパク質抽出に十分な適切なフラスコにがん細胞を播種します。その後、10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した培地で一晩インキュベートします。
翌日、培地中のmicroRNA 143およびmicroRNA 506をそれぞれ100ナノモルの濃度で希釈することにより、トランスフェクション用のmicroRNAサンプルを調製します。インキュベーターからフラスコを取り出し、培地を取り出します。1 x PBSで洗浄します。
未処理のすべてのコントロールには、細胞を含む不完全な培地のみが含まれます。インキュベーター内で細胞をトランスフェクション培地と6時間インキュベートします。6時間後、メディアを取り外し、4ミリリットルの新鮮な完全なメディアと交換します。24時間後と48時間後にトリプシン処理により細胞を収穫します。
次に、各チューブに1x PBSを入れて2回洗浄し、上清を取り除きます。後でRNA抽出を行うためには、細胞をマイナス80°Cで凍結します。
- RNA抽出は、RNAキットを使用して、製造元の指示に従って行いました。まず、マイナス80°Cからチューブを取り外し、解凍します。
- 300マイクロリットルの溶解バッファーとピペットを上下に添加して細胞膜を破壊します。等量の100%超高純度エタノールを加えます。次に、よく混ぜて分離カラムに入れます。遠心分離機にかけ、流れを取り除きます。
400マイクロリットルの洗浄バッファーと遠心分離機を追加してバッファーを除去します。各サンプルに5マイクロリットルのDNAse Iと75マイクロリットルのDNA消化バッファーを加え、15分間インキュベートします。次に、サンプルを400マイクロリットルのRNA調製バッファーで洗浄します。
次に、RNA洗浄バッファーで2回洗浄します。次に、ヌクレアーゼフリーの水をカラムに加え、遠心分離してRNAを回収します。RNA濃度を測定すると、この段階では、2マイクログラムのRNAサンプルをRNAシーケンシングに送ることができます。