細胞周期解析:miRNAトランスフェクション肺がん細胞の細胞周期調節を研究するためのアプローチ

- マイクロRNAまたはmiRNAは、小さなノンコーディングRNAです。mRNAトランスフェクションまたは細胞への導入後、miRNAタンパク質複合体を形成します。この複合体は、特定のmRNAを標的にして結合し、その発現を負に制御して、細胞周期の進行を止めます。

解析を開始するには、miRNAトランスフェクション肺がん細胞の回収培養物に適切な脱水固定剤を添加します。固定液は細胞を保存し、細胞膜を透過化します。ヨウ化プロピジウム、蛍光核酸色素、およびリボヌクレアーゼ酵素の混合物に細胞を治療します。

色素は細胞に入り、DNAとRNAの両方を染色します。酵素はRNAを特異的に分解し、最適なDNA定量を可能にします。フローサイトメーターを使用して、個々の細胞の蛍光強度に基づいて、異なる細胞周期フェーズで停止した細胞の割合を決定します。

休止期および成長期の細胞はDNA含有量が低いため、蛍光強度が低くなります。DNAの量が2倍になったGap 2期の細胞は、2倍の蛍光強度を産生します。DNA合成段階の細胞は、他の2つの集団間で蛍光値を誘導します。次のプロトコルでは、PI 染色とフローサイトメトリーを使用して DNA 含有量を測定することにより、miRNA で処理された肺がん細胞の細胞周期調節を分析します。

- このビデオの前のセクションで説明したように、細胞をトランスフェクションします。トリプシン処理により、各サンプルから別々の15ミリリットルの滅菌チューブで細胞を採取します。次に、751 gで5分間遠心分離することにより、1X PBSで細胞を2回洗浄し、上清を除去します。ピペッティングで200マイクロリットルの氷冷1X PBSを加えて、ペレットを再懸濁して破砕します。

2ミリリットルの70%氷冷エタノールをチューブに滴下しながら、チューブを穏やかにボルテックスして細胞を固定します。チューブを室温で30分間インキュベートし、4°Cに1時間置く。チューブを摂氏4度から取り外し、遠心分離します。

氷冷したPBSとボルテックス2mLを加え、遠心分離により上清を除去します。ヨウ化プロピジウムとリボヌクレアーゼAをそれぞれ50マイクログラム/ミリリットルと200マイクログラム/ミリリットルの濃度で含有する1X PBSを各サンプルに500マイクロリットル加え、室温で30分間インキュベートします。光から保護する適切なチューブにサンプルを移し、フローサイトメーターで泳ぎます。