ゼブラフィッシュ異種移植糸アッセイ:ゼブラフィッシュの腫瘍原性に対する治療薬の抗がん効果をIn vivoで評価する方法

- まず、卵をペトリ皿に入れ、ダニオーの溶液を加えて、採れたての卵を維持します。フェニルチオ尿素を添加して色素沈着を抑制し、数日間インキュベートします。インキュベーション後、鋭い鉗子を使用して胚を脱角し、さらに成長させます。

次に、培養フラスコに所望の数のがん細胞を播種し、一晩インキュベートします。次に、抗がん剤を添加し、さらにインキュベートします。インキュベーション後、細胞膜に結合して細胞を染色する蛍光セルトラッカー色素を添加します。

次に、細胞解離のためにトリプシンを添加し、pHを評価する手順の前にフェノールレッドPBS溶液で細胞を希釈します。麻酔をかけたゼブラフィッシュの胚を寒天プレートにマウントします。次に、マイクロキャピラリーにがん細胞懸濁液をロードし、胚の卵黄嚢に注入します。

ダニオー溶液を含む培養プレートに胚を移し、さらにインキュベートします。次に、スライドガラス上でいくつかの胚を移植し、メチルセルロースを加えて固定化します。スライドを蛍光顕微鏡の下に置き、ソフトウェアを使用して腫瘍のサイズを定量化します。

抗がん剤は通常、がん細胞の腫瘍形成能力を阻害します。次のプロトコルでは、ヒドロキシクマリンとBH3模倣物の効果を研究します in vivo ゼブラフィッシュの腫瘍形成。

- A549細胞を播種し、テキストプロトコルに従って化合物とインキュベートした後、処理終了の24時間前に、細胞を染色するために蛍光セルトラッカー色素CM-Dilの4マイクロモルを加え、それらを2時間インキュベートする。

インキュベーション後、0.05%トリプシンEDTAを使用して細胞をトリプシン化します。次に、注射前に50マイクロリットルのフェノールレッドPBS溶液で10〜6番目の細胞を希釈します。がん細胞のマイクロインジェクションを行うには、以下のプログラム設定で1.0mmガラスキャピラリーを引っ張ります。

シリンジを使用してキャピラリーを切断し、鋭いエッジを生成します。次に、マイクロキャピラリーに20マイクロリットルのセルフェノールレッド溶液をロードします。テキストプロトコルに従ってゼブラフィッシュに麻酔をかけた後、3〜5回の注入で6〜10ナノリットルを注入することにより、100〜200個の細胞を卵黄嚢に注入します。

- マイクロインジェクションは、正しい量の細胞が注入され、注射による損傷が最小限に抑えられ、魚の致死を避けるために二酸化炭素圧力が最適であることを確認するために、非常に慎重かつ正確に行われるべきです。

- 注射後、PTUを含む新鮮なダニオー溶液の5ミリリットルで魚を10〜30分間回復させます。魚を1ミリリットルのダニオーPTU溶液で24ウェルプレートに移し、摂氏28.5度で72時間インキュベートします。インキュベーション後、テキストプロトコルに従って魚を麻