JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:59 分 • April 30th, 2023
- マイクロRNA(miRNA)は、遺伝子調節に関与する小さなノンコーディングRNAです。それらの発現は癌の間に変化するため、潜在的な癌バイオマーカーです。miRNAの単離を開始するには、新たに採取した全血サンプルを採取し、摂氏4度で遠心分離して血漿を血液細胞から分離します。上清を新しいチューブに移し、再度遠心分離して、より透明な血漿上清を得ます。上清を抽出し、冷却した均質化溶液で処理し、続いて溶解バッファーでサンプルを均質化します。プロテイナーゼK酵素溶液を添加して、タンパク質、特に下流のステップでRNAを消化するヌクレアーゼを分解します。
- 次に、ライセートを組み立て済みの機器特異的核酸抽出カートリッジの指定ウェルにロードします。DNase 1溶液を適切なウェルに添加して、サンプルからゲノムDNAを除去します。カートリッジに組み立てた溶出チューブにヌクレアーゼフリーの水を加え、miRNA単離前にコンディショニングを行います。カートリッジアセンブリを核酸抽出器にロードします。適切なmiRNA精製ソフトウェアを選択して実行します。完了したら、miRNAを含む溶出チューブを取り出し、マイナス80°Cで保存します。
- 以下のプロトコールでは、肺がん検診のための患者血液サンプルからのmiRNA抽出を示します。
- このプロトコルを開始するには、バキュテナーチューブを使用して10ミリリットルの全血サンプルを採取します。室温で保存してください。
- 全血を4°Cなどの低温で保存しないでください。これは、非特異的なmicroRNAの放出につながる熱ショックや細胞溶解を避けるためです。
- 血漿を1時間以内に遠心分離して分離します。リンパ球輪との接触を避けながら、上清を15ミリリットルのチューブに移します。次に、同じ条件で上清を遠心分離します。この血漿上清1ミリリットルを1.5ミリメートルのクライオバイアルに分注し、チューブの底から血漿画分が収集されないように注意します。RNAの単離を開始するには、各サンプルの200マイクロリットルの血漿に200マイクロリットルの予冷OMG溶液を追加します。完全な均質化を確実にするために、15〜30秒間ボルテックスします。サンプルを均質化するには、サンプルあたり200マイクロリットルの溶解バッファーと25マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、20秒間ボルテックスします。
- 次に、サンプルを摂氏37度でサーモミキサーで15分間インキュベートします。次に、RSC miRNA組織法を選択し、核酸自動抽出器のデッキトレイに各サンプルのカートリッジをロードし、プランジャーを適切に配置します。ライセートを移し、5マイクロリットルのDNase 1溶液を装置カートリッジ内の適切な位置に加えます。各溶出チューブの基部に、60マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。自動精製を開始するには、実行を開始します。総RNAサンプルは摂氏マイナス80度で保存します。