免疫組織化学的染色:薄い組織切片から空間情報を取得する方法

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- まず、薄い組織切片をアンモニア溶液に入れて、穏やかな抗原賦活化を可能にします。切片をポリリジンコーティングされたスライドに移します。負に帯電した細胞は、正に帯電したポリリジンに結合します。次に、過酸化水素を添加して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。スライドをTris-Buffered Saline、TBSで洗います。

TBSは、タンパク質の架橋を切断することにより、抗原に対する抗体のアクセスを促進します。切片をブロック溶液で洗浄し、非特異的抗体の結合を減らします。一次抗体を切片に添加し、一晩インキュベートします。一次抗体は、細胞表面に存在するその特異的抗原に結合します。スライドをTBSで洗います。

一次抗体のFc領域に付着するビオチン標識二次抗体を添加します。切片をストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ酵素で洗浄します。次に、ペルオキシダーゼの発色基質を組織に加えます。ペルオキシダーゼは、発色剤を着色された不溶性生成物に変換します。

組織をヘマトキシリン溶液で対比染色します。ヘマトキシリンは細胞の酸性成分に結合し、細胞を青色に変えます。光学顕微鏡で組織を観察します。抗原は赤で検出されますが、細胞はヘマトキシリンのために青く見えます。次のプロトコルでは、免疫組織化学染色を行い、気管支内生検からCD45およびCD1a細胞を同定します。

- 埋め込まれた生検組織を切片化する前に、ナイフホルダーを生検ブロックの角度で慎重に調整して、ブレードがブロックの表面に対して平らになるようにします。次に、各気管支内生検サンプルから少なくとも 2 ミクロンの厚さの切片をゆっくりと切断し、鉗子を使用して、切断したばかりの各組織スライスを 0.05% アンモニアと蒸留水溶液に移します。45〜90秒後、ポリ-l-リジンコーティングされた顕微鏡スライドを使用して、展開された各切片をピックアップし、切片を少なくとも1時間乾燥させます。

切片が乾いたら、実験に適したラベルをスライドに貼り、各サンプルの周囲に疎水性バリアを描きます。次に、新たに調製したペルオキシダーゼブロック溶液1ミリリットルを切片に塗布します。30分後、ペルオキシダーゼブロック溶液を取り出し、切片をTBSで5分間3回洗浄した後、TBSを除去し、1% BSAブロッキング溶液をさらに30分間インキュベートして、非特異的抗体の結合をブロックします。

インキュベーションの最後に、TBSで希釈した目的の一次抗体を添加し、サンプルをカバースリップして室温で一晩インキュベートします。翌朝、スライドをTBSで3回洗浄し、目的の二次抗体を室温で2時間適用します。インキュベーションの終了時に、スライドを新鮮なTBSでさらに3回洗浄し、新たに調製したストレプトアビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体溶液で室温で2時間サンプルをインキュベートした後、さらに3回のTBS洗浄を行います。

次に、新たに調製したAECペルオキシダーゼ基質溶液で20〜30分間皿を処理します。目的の染色強度が現れたら、スライドを流水で5分間すすぎ、ろ過したメイヤーのヘマトキシリン溶液で切片を対比染色します。2分後、流水でさらに5分間スライドを洗浄し、スライドを水気を切り、切片を永久的な水性封入剤で覆い、摂氏80度の乾燥オーブンでサンプルを乾燥させます。

冷却後、DPX封入剤とカバースリップをセットしたサンプルを光学顕微鏡に40倍倍で分析します。

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Last updated: 18 July 2026