3D DNA FISH:染色体上の特定の遺伝子を見つける技術

- 表面に細胞が付着し、免疫蛍光染色で染色された官能基化ワイヤーを取ります。氷冷した生理食塩水クエン酸ナトリウムまたはSSC溶液で洗います。蛍光タグ付きプローブが入ったマイクロチューブにワイヤーを入れ、ワイヤーストッパーで閉じます。マイクロチューブを暗湿チャンバー内の75°Cのハイブリダイゼーションオーブンでインキュベートし、細胞内のDNAを変性させます。

チャンバーを摂氏37度のオーブンに移し、プローブがDNA上の相補配列に結合します。次に、チャンバーをオーブンから取り外し、ワイヤーを取り出します。SSC溶液が入ったチューブにワイヤーを希望の温度に浸します。Tweenを含むSSC溶液でワイヤーを洗浄して、非特異的または部分的にハイブリダイズされたプローブを除去し、蒸留水で再度洗浄します。

ワイヤーを乾燥させ、官能基化チップをDAPI溶液でインキュベートして、細胞の核を染色します。ワイヤーをPBSですすぎ、風乾します。ワイヤーを蛍光顕微鏡の下に置きます。目的遺伝子とハイブリダイズされたプローブは、細胞の核内に蛍光スポットとして現れます。次のプロトコルでは、3D DNA FISHを実行して、肺がん細胞におけるALK遺伝子の転座を決定します。

- DNA FISHプロトコルの3時間前に、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏75度に設定し、乾熱オーブンを摂氏37度に設定します。0.4倍SSC溶液を摂氏4度に冷却します。氷冷した0.4倍SSC溶液でワイヤーを3回洗います。ヒュームフードの食器棚の下の暗闇でワイヤーを10分間乾かします。

10分後、プローブを渦巻き、5秒間回転させます。プローブの10マイクロリットルをガラスマイクロチューブに落とし、実験用フィルムで覆います。マイクロチューブを乾燥した吸収性のある紙で包み、50ミリリットルのチューブに入れ、短時間回転させます。乾燥させたワイヤーをマイクロチューブに慎重に入れ、ワイヤーストッパーを挿入します。次に、ワイヤーストッパーをゴムセメントで密封します。

ハイブリダイゼーションオーブン内の暗く湿ったチャンバーにワイヤーを75°Cで8分間入れ、完全なDNA変性を得る。8分後、湿ったチャンバーを摂氏37度の乾熱オーブンに一晩移します。0.4倍SSC溶液を入れたスライド染色ジャーを、摂氏72度に設定したウォーターバスに入れます。0.4倍のSSC溶液の温度が摂氏72度またはマイナス1度に達するまで確認します。

次に、2つのガラスビーカーを準備します-1つは2倍SSCと0.05%Tween溶液、もう1つは蒸留水です。湿ったチャンバーを乾熱オーブンから取り出します。ピンセットを使用して、ワイヤーストッパーからゴムセメントを慎重に取り除き、コーティングされていないワイヤーの端をエンドストッパーに通します。

ワイヤーを0.4倍SSC