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- まず、新たに調製した培地にヒト白血病細胞を播種し、所望の期間インキュベートします。インキュベーション後、この細胞懸濁液を少量トリパンブルーで染色し、TC20細胞カウンタースライドを使用して細胞生存率を評価します。死細胞は透過性で負に帯電した色素を取り込みますが、生細胞は不透過性です。
次に、メチルベータシクロデキストリンを培養フラスコに加えて、細胞のコレステロールを十分に枯渇させ、超音波にかかりやすくします。細胞を所望の期間インキュベートします。細胞超音波処理システムに脱イオン水を満たし、真空気泡を避けるために数分間脱気します。シンチレーションバイアル内の所望の量の細胞を移し、バイアルを細胞超音波処理システムの保持装置に取り付けます。
保持装置をホーンの上に置き、ホーンの上部から希望の高さを設定します。細胞を超音波処理するために必要なパルスを所望の期間に設定します。細胞懸濁液にトリパンブルーを添加し、TC20セルカウンターに置いて、細胞の生存率と損傷を分析します。メチルベータシクロデキストリンで処理された白血病細胞は、低周波超音波にさらされると、有意な細胞溶解を示します。
次のプロトコルでは、ヒト白血病細胞の細胞超音波処理と損傷評価を研究します。
- 超音波処理のために細胞を準備するために、最初にそれらを4倍で10倍から4番目の細胞で25平方センチメートルのフラスコに25平方センチメートルのフラスコで播種する。トリパンブルー排除法により生細胞数を決定した後、培養物が所望の濃度に達するまで、37°Cおよび5%の二酸化炭素で培養物をインキュベートする。細胞が超音波処理の準備ができたら、真空フラスコとブフナーフラスコを使用して、イオン化蒸留水の量を脱気します。次に、水を使用して、ホーンの上部から最大15ミリメートルまでカップホーンを満たします。
脱気した水でシステムを約7分間運転し、次に3ミリリットルの細胞をガラス製の20ミリリットルシンチレーションバイアルに移し、バイアルを保持装置に取り付けます。次に、カップホーンの上部に保持装置を取り付け、スライド機構を使用して、水面のホーン上部から15ミリメートルの高さに保持装置をセットします。次に、33%から50%の振幅で各パルス間に1秒の間隔を空けて、1秒の超音波パルスを3回1秒の超音波処理します。
トリパンブルー排除による超音波処理後の細胞生存率を評価します。細胞の損傷を評価するには、Z2粒子分析装置の開口部を等張生理食塩水で少なくとも2回洗い流します。次に、超音波処理した細胞100マイクロリットルを20ミリリットルの等張生理食塩水に加え、細胞サンプルをカウンターホルダーに移します。次に、プラットフォームを開口部まで上げ、製造元の指示に従ってセルの損傷、生存率、および破片を分析します。