JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:20 分 • April 30th, 2023
- 低周波超音波はヒト白血病細胞の選択的溶解につながり、XTTアッセイはこの損傷の程度を決定するのに役立ちます。このアッセイは、健康な細胞のミトコンドリア酵素が黄色のXTT色素をホルマザンと呼ばれるオレンジ色の化合物に変換するという原理に基づいて行われます。アッセイを開始するには、コレステロール減少剤であるメチルβ-シクロデキストリンで細胞を処理し、その後、細胞を低電力で超音波処理して細胞損傷を誘発します。
遠心分離機で細胞をペレット化し、新鮮な細胞増殖培地をペレットに加えます。細胞を所望の濃度でマルチウェルマイクロプレートに播種し、一晩インキュベートします。次に、活性化したXTT溶液を細胞に加え、マイクロプレートのウェル内でオレンジ色が発色するまでインキュベートします。プレートを分光光度計に置きます。450〜500ナノメートルで吸光度を測定し、次に630〜690ナノメートルで吸光度を測定します。正確な結果を得るには、2 つの値を減算します。XTTアッセイの吸光度の値が高いほど、ミトコンドリア酵素の活性が高く、細胞生存率が高いことを示しています。
次のビデオでは、メチルベータシクロデキストリンで治療された白血病細胞に細胞損傷を引き起こす低周波超音波の有効性を判断するためのXTTアッセイの使用を示します。
- XTTアッセイによって超音波処理された細胞の生存率を評価するには、1秒間隔で1〜3回の1秒パルスの範囲を使用して細胞を超音波処理し、XTTキットが評価するための損傷の範囲を発症します。次に、細胞をスピンダウンし、新たに調製した増殖培地でペレットを1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍に再懸濁します。次に、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を、ブランク吸光度を読み取るための完全な増殖培地のみの100マイクロリットルを含む3つのコントロールウェルを含む、個々の平底96ウェルマイクロタイタープレートに三重に播種します。細胞を24時間インキュベートします。
アッセイの朝、37°C温めたXTTと活性化試薬のアリコートを、溶液が透明になるまで穏やかに渦巻かせます。次に、0.1ミリリットルの活性化試薬をXTT試薬の5ミリリットルアリコートに加えます。次に、活性化したXTT溶液をU937およびTHP1接種プレートの各ウェルに50マイクロリットル加え、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。2時間後、プレートを静かに振って、オレンジ色の色素をポジティブウェルに均一に分散させ、マイクロタイタープレートリーダーで450〜500ナノメートルの吸光度を測定します。最後に、すべてのアッセイウェルの吸光度を630〜690ナノメートルの間で再度測定します。