0 閲覧数 • 3:24 分 • April 30th, 2023
- ブロモデオキシウリジンまたはBrdUは、合成チミジンヌクレオシド類似体です。細胞周期の合成段階では、BrdUはチミジンを置換し、新たに合成されたDNAに組み込みます。組み込まれたBrdUにより、細胞周期の進行を追跡できます。取り込まれたBrdUを検出するには、まず細胞を固定して透過処理し、透過性にします。
次に、細胞をDNAse酵素で処理してDNA鎖を切断し、取り込まれたBrdUを露出させます。続いて、適切な蛍光標識抗BrdU抗体を添加します。抗体は核に入り、DNAに存在する曝露されたBrdUに容易に結合します。
さらに、適切な蛍光DNA結合色素で細胞を処理します。色素はDNAに結合するため、総DNA含有量の定量化が可能になります。フローサイトメトリーを使用して、標識されたBrdUとDNAの両方からの蛍光を検出します。
標識されたDNAからの蛍光強度は、総DNA含有量の変動に基づいて、異なる細胞周期相の細胞を分化します。BrdUからの蛍光シグナルは、BrdUで取り込まれた細胞の現在の細胞周期の位置を特定します。
この例では、NALM-6--急性リンパ芽球性白血病細胞のBrdU免疫蛍光染色を行います。
- 抗体染色の前に、細胞をDNAseで処理します。細胞を100マイクロリットルのDNAse溶液に再懸濁し、摂氏37度で1時間インキュベートします。1ミリリットルの洗浄バッファーを加え、細胞を遠心分離し、上清を捨てます。BrdU以外の細胞内マーカーの抗体染色は、BrdU染色と同時に行うことができます。
- 未染色の細胞と各蛍光色素で標識された細胞からなるコンペンセーションコントロールを調製することが重要です。コンペンセーションコントロールには、実験用チューブに使用した抗体と同じ抗体を使用するのが理想的です。
- BrdU抗体の6細胞に10個あたり1マイクロリットルの50マイクロリットルの洗浄緩衝液に細胞を再懸濁した。他の特異的な細胞内抗原に対する抗体を使用する場合は、この時点で抗体を追加する必要があります。細胞を室温で20分間インキュベートします。
20分後、前述したように1ミリリットルの洗浄緩衝液で細胞を洗浄します。最後に、細胞周期解析のためにDNAを染色します。チューブをフリックしてペレットをほぐし、20マイクロリットルの7-AAD溶液を追加します。細胞ごとに一定量の7-AADを使用することが重要です。細胞を1ミリリットルの染色緩衝液に再懸濁します。その後、フローサイトメトリー解析を行います。