BMSCsを用いた白血病細胞の2D共培養:白血病細胞の亜集団を得る方法

- 2D共培養システムでは、複数の細胞タイプを平らな培養プレートで一緒に増殖させます。この培養システムは、in vitroでの細胞の相互作用と挙動の研究を容易にします。骨髄間質細胞(BMSC)との白血病細胞共培養を確立するには、BMSCの接着性単層培養に白血病細胞懸濁液を添加し、適切な培養条件下でプレートをインキュベートします。4日ごとに培地の90%を交換することにより、共培養を維持します。

この2D共培養では、白血病細胞はBMSCと相互作用し、培養内の異なる領域に局在化して、3つの亜集団を形成します。位相差顕微鏡法は、3つの亜集団を視覚的に区別することを可能にします。培地中に自由に浮遊しているように見える白血病細胞の最初のグループは、懸濁細胞として分類されます。BMSC単層の表面に付着した白血病細胞の2番目のグループは明るく見え、位相明るい細胞として分類されます。

単層の下に移動した白血病細胞の3番目のグループは薄暗く見え、位相薄暗い細胞として分類されます。次のプロトコルでは、急性リンパ芽球性白血病、またはALL細胞とヒト骨髄間質細胞の共培養を行います。

- 腫瘍特異的培養液の10ミリリットル中の5〜20倍10〜6番目の白血病細胞を80%〜90%のコンフルエント骨髄間質細胞または骨芽細胞の100ミリメートルプレートに播種することから始めます。4日ごとにプレートを横に傾け、付着した細胞層を乱さないように注意しながら、1ミリリットルを除くすべての培地を吸引します。次に、9ミリリットルの新鮮な白血病細胞培養培地をプレートの側面に沿ってプレートの角に慎重に滴下して、接着細胞の破壊を最小限に抑えます。

共培養の12日目以降、培養培地をプレート上で約5〜10回静かに上下させて浮遊白血病細胞を採取し、細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。次に、先ほど示したように、80%から90%のコンフルエントな骨髄間質細胞または骨芽細胞の新しいプレートに細胞を再播種します。4日目までに、白血病細胞の3つの亜集団が形成され、懸濁した白血病細胞は培地中に自由に浮遊し、位相明るい白血病細胞は接着細胞単層の表面に付着し、位相薄暗い白血病細胞は単層の下に移動します。