0 閲覧数 • 3:18 分 • April 30th, 2023
- まず、麻酔をかけたマウスの首をつかんで目を突き出します。細い毛細血管を眼の内側眼瞼に挿入します。毛細管現象によって血液がチューブに流れるのを待ちます。血液をEDTAコーティングチューブに移し、氷上で維持します。EDTAはカルシウムイオンと結合し、血液凝固を防ぎます。温度が低いと、細胞の解糖活性が低下し、微生物汚染の可能性が低くなります。
次に、EDTAを含むバッファーで血液を希釈し、よく混合します。血液を乱さずに、適切な分離溶液の層を底に慎重に追加します。懸濁液を遠心分離します。分離液中のポリマーは、赤血球と底部の沈殿物を凝集させます。単核細胞および血小板は、ポリマーよりも軽量であり、ポリマー勾配より上に沈着する。
血漿を含む最上層を取り外し、単核細胞を含む不透明な白いリングを収集します。PBSを使用して細胞を希釈し、遠心分離機で残留血漿と血小板を除去します。単離された単核細胞は、さらなる分析に使用します。次のプロトコルは、白血病細胞株C1498を注入した同遺伝子マウスからの単核細胞の単離を実証します。
- 麻酔をかけた白血病動物の眼の内側眼瞼に毛細血管を挿入します。眼窩洞から毛細血管に100〜200マイクロリットルの血液が引き出されます。チューブを取り外し、滅菌ガーゼスポンジを目に優しく塗布して出血を抑えます。次に、血液をEDTAチューブに移し、単核細胞が分離されるまでチューブを氷上に保存します。
血液単核細胞を単離するには、まず、1ミリモルEDTAを添加したPBSを最終容量500マイクロリットルまで追加します。次に、サンプルを微量遠心チューブに移します。次に、30ゲージの針がついた1ミリリットルの注射器で、500マイクロリットルの分離液を血液の下に混ぜないように注意しながら慎重に重ねます。
遠心分離によって細胞を分離し、ピペットを使用して不透明な白い単核細胞層を新しい微量遠心チューブに移します。次に、免疫細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄します。それらを遠心分離し、ペレットを600マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁して、フローサイトメトリーによる染色および分析を行います。