密度勾配遠心分離法:末梢血からCLL細胞を単離する方法

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- 慢性リンパ性白血病(CLL)患者では、B細胞リンパ球は骨髄および血液中で有意に増加する。これらのCLL細胞を血液サンプルから単離するには、まず、ネガティブセレクションを使用してB細胞を分離するヒトB細胞濃縮カクテルでサンプルを処理します。カクテル中の抗体は、非B細胞や赤血球によって発現される抗原を特異的に認識して架橋し、密集した複合体を形成します。

次に、リンパ球の単離に最適な密度を有する密度勾配培地上にサンプルを重ねます。その後の遠心分離では、異なる血液成分は、グラジエント培地に対するそれらの密度の変動に基づいて分離します。高密度のRBC-非B細胞複合体は、培地を通じて沈降し、ペレットを形成します。最も密度の低い血漿画分が最上層を形成します。密度の低いCLL細胞は、血漿密度媒体界面に白い層を形成します。

白い層を新しいチューブに慎重に移します。再度遠心分離して、精製されたCLL細胞を含むペレットを得ます。次のプロトコルでは、患者の血液サンプルからの慢性リンパ性白血病細胞の分離を示します。

-以前に同意した慢性リンパ性白血病患者から末梢血サンプルを採取します EDTA採血チューブで 白血球数を伴う。

- ヒトの血液サンプルには血液媒介性ウイルスが含まれている可能性があるため、危険物と見なす必要があります。これらのサンプルはクラスIIバイオセーフティキャビネットで取り扱われ、ユーザーは常に白衣と手袋を着用していることを確認してください。血液で汚染された物質を処分し、これらを消毒します。

- 白血球数が1ミリリットルあたり4,000万細胞以上の場合は、サンプルをRT CLL洗浄バッファーで1対1の比率で希釈します。次に、RT密度グラジエント培地をサンプルに適したサイズの円錐形遠心チューブに分注します。培地の上にサンプルを慎重に重ね、Gの400倍でRTで30分間遠心分離します。

プラスチック製のパスツールピペットを使用して、密度勾配培地とCLL洗浄バッファーの界面に集まった単核細胞の白い層を穏やかに回収します。この単分子膜を新鮮な50ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。細胞を洗浄するには、この単層に40ミリリットルのCLL洗浄バッファーを加え、Gの300倍で室温で10分間遠心分離します。

上清を捨て、チューブの底をフリックしてペレットを再懸濁し、この洗浄を繰り返します。上清を捨て、チューブの底を再度フリックしてから、ペレットのサイズに応じて、細胞ペレットを設定容量のCLL洗浄バッファーに再懸濁します。細胞をカウントし、フローサイトメトリーで細胞の純度を確認した後、必要な細胞密度の組織培養プレートに細胞を入れ、刺激または薬物治療の準備をします。

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Last updated: 18 July 2026