白血病細胞からの細胞内画分の調製:白血病細胞から細胞画分および核画分を生成する方法

- 白血病細胞では、核と細胞質の間のいくつかの腫瘍抑制タンパク質などの高分子の往復が制御解除されます。これらのタンパク質の誤局在化はそれらを不活性にし、白血病細胞の制御不能な増殖をもたらします。このようなタンパク質の異常な位置は、白血病細胞から細胞質画分と核分画を生成することで決定できます。

まず、マイクロチューブに希望量の白血病細胞を取り込み、遠心分離して細胞をペレット化します。ペレットを低張溶解バッファーに再懸濁し、必要な濃度の界面活性剤を添加します。低張溶解バッファーは、細胞を膨らませて原形質膜を破壊し、核膜を無傷のままにして、細胞質画分を分離します。界面活性剤は、細胞質オルガネラからのタンパク質の抽出に役立ちます。

溶解した細胞を懸濁液中で遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。上清には、細胞の細胞質画分が含まれています。核画分を調製するには、残りのペレットを完全な溶解バッファーに再懸濁し、界面活性剤を添加します。遠心分離機にかけ、上清に存在する核画分をマイクロチューブに集めます。細胞質画分と核画分を摂氏マイナス80度で保存して、さらに分析します。以下のプロトコルでは、白血病細胞からの細胞内画分の生成を実演します。

刺激および/または薬物治療のインキュベーションが完了した後、細胞を個々に標識した1.5ミリリットルのマイクロチューブおよびペレットに移し、摂氏4度で200倍gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、ホスファターゼ阻害剤を含む1ミリリットルの氷冷PBSに細胞ペレットを再懸濁します。摂氏4度で200倍gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、これらの全細胞抽出ペレットを氷上に置いて、さらに調製します。

細胞質画分を調製するには、細胞ペレットを1 X hypotonic緩衝液50マイクロリットルに穏やかに再懸濁します。細胞を膨潤させるために、氷上で15分間インキュベートします。界面活性剤グラジエントを実施して、特定の細胞タイプに使用する界面活性剤の最適濃度を決定した後、各サンプルに0.8〜2.5マイクロリットルの界面活性剤を加え、最高設定で10秒間ボルテックスします。

細胞溶解を確認するには、界面活性剤を添加する前と添加後の位相差顕微鏡で細胞を観察します。すべての細胞は、明るいハローとして現れる細胞質に囲まれた、密集した暗い核を持っています。溶解したら、サンプルを14,000 gで摂氏4度で30秒間遠心分離します。ペレットを乱さないように慎重に、上清を事前に冷却した標識されたマイクロフュージチューブに移し、この細胞質画分を摂氏マイナス80度で保存します。

核分画の汚染を防ぐために、細胞質画分の完全な除去を確実にします。

核画分を含む残りのペレットに、50マイクロリットルの完全溶解緩衝液を加え、ピペッティングで上下させて再懸濁します。核膜に関連するタンパク質を可溶化するには、2.5マイクロリットルの界面活性剤を加え、最高設定で10秒間ボルテックスし、氷上で30分間インキュベートします。最高設定で30秒間ボルテックスし、遠心分離します。次に、上清をあらかじめ冷却した標識マイクロチューブに移し、この核画分を摂氏マイナス80度で保存し、さらなる分析まで待ちます。