T細胞濃縮:磁気分離により混合細胞集団からT細胞を単離する技術

- リンパ球の一種であるT細胞は、感染と戦う上で積極的な役割を果たしています。他の複数の血液細胞タイプとともに、免疫適格T細胞はマウスの脾臓とリンパ節に存在します。T細胞を選択的に単離するには、マウスの脾臓とリンパ節を採取し、細胞ストレーナーで浸軟します。組織を適切な培地で洗い流し、単一細胞懸濁液を得ます。

塩化アンモニウムカリウム(ACK緩衝液)を添加して、赤血球を溶解します。遠心分離機で無傷の血液細胞を溶解液から分離します。上清を捨て、細胞を適切なバッファーに再懸濁します。顆粒球、B細胞、NK細胞、および残りの赤血球などの血液細胞を標的とするビオチン化抗マウス抗体の混合物で懸濁液を処理します。T細胞は標的とされないため、タグが付けられません。

次に、懸濁液に抗ビオチン磁性マイクロビーズを添加します。ビオチン標識されたすべての細胞はマイクロビーズに結合します。強い磁場の影響下に保持すると、磁気的に標識された細胞はチューブ壁に付着します。非標識T細胞は懸濁液のままです。結合していない濃縮T細胞を新しい収集チューブに収集します。次のプロトコルでは、マウスの脾臓とリンパ節からのT細胞の分離を、磁気分離技術を利用して示します。

- リンパ節と脾臓を40マイクロメートルの細孔ストレーナーにプールし、シリンジプランジャーを使用してフィルターを通して組織を浸軟させ、細胞を放出します。ストレーナーとプランジャーを1% FBSを添加したRPMI培地で洗浄し、すべての細胞を回収し、遠心分離によって細胞を沈殿させます。5ミリリットルのACK溶解バッファーを細胞ペレットに加えます。

室温で5分後、1%FBSを添加した5ミリリットルの培地で反応を停止し、遠心分離により白血球をペレット化します。ペレットを5ミリリットルのMACS緩衝液に再懸濁してカウントし、細胞を新鮮なMACS緩衝液で1マイクロリットルあたり8細胞の10の2倍の濃度に希釈します。6つの細胞に1×10あたり適切な濃度の抗赤血球抗体、抗顆粒球抗体、抗B細胞抗体、抗NK細胞枯渇抗体を添加し、4°Cで15分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、10ミリメートルの氷冷MACS緩衝液で細胞を洗浄し、ペレットを新鮮なMACS緩衝液に10の1倍から8細胞/mLの濃度で再懸濁します。次に、6つの細胞に1×10あたり0.22マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを加え、4°Cで15分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、10ミリリットルの氷冷MACSバッファーで細胞を洗浄し、標準的なビーズ分離プロトコルに従ってMACS Expressセパレーターを使用した磁気ビーズ分離により、結合していない濃縮T細胞を回収します。分離の最後に、遠心分離によってT細胞を沈殿させ、ペレットを5ミリリットルの新鮮なMACS緩衝液に再懸濁してカウントします。