Name: プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-02T17:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: 学ぶDNA安定同位体プロービング（DNA-SIP）による培養不要の微生物同定法。環境サンプルに重同位体標識基質を添加し、密度勾配遠心分離でDNAを分画して、活性微生物群集の代謝機能を解明します。

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この作品は、戦略的プロジェクトとカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）からJDNのディスカバリーの補助金によって支えられている。

<ol><li>Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA stable-isotope probing.</a> Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-specific+clades+of+active+marine+methylotrophs+associated+with+a+phytoplankton+bloom+in+a+temperate+coastal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).</li>
<li>Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+populations+active+in+metabolism+of+C1+compounds+in+the+sediment+of+Lake+Washington%2C+a+freshwater+lake%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).</li>
<li>Padmanabhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration+of+13C-labelled+substrates+added+to+soil+in+the+field+and+subsequent+16S+rRNA+gene+analysis+of+13C-labelled+soil+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).</li>
<li>Bernard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+identification+of+soil+microbial+populations+actively+assimilating+carbon+from+13C-labelled+wheat+residue+as+estimated+by+DNA-+and+RNA-SIP+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques.</a> Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).</li>
<li>Haichar, elZ. ahar, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cellulolytic+bacteria+in+soil+by+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing.</a> Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).</li>
<li>Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing%3A+Technical+considerations+when+resolving+15N-labelled+RNA+in+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients.</a> J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).</li>
<li>Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+probing+with+15N+achieved+by+disentangling+the+effects+of+genome+G+%2B+C+content+and+isotope+enrichment+on+DNA+density%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).</li>
<li>Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+growing+microorganisms+in+soil+by+stable+isotope+probing+with+H218O%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).</li>
<li>Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+the+use+of+stable+isotope+probing+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology.</a> Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).</li>
<li>Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+SYBR+safe+technique+for+the+sensitive+detection+of+DNA+in+cesium+chloride+density+gradients+for+stable+isotope+probing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays.</a> J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).</li>
<li>Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+contamination+of+glycogen+used+in+nucleic+acid+precipitation+and+assessment+of+linear+polyacrylamide+as+an+alternative+co-precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant.</a> Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+uncultivated+majority%3A+combining+DNA+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomic+analyses+of+uncultivated+Methylocystis+in+acidic+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands.</a> Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).</li>
<li>Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+methylotrophs+revealed+by+stable-isotope+probing%2C+multiple+displacement+amplification+and+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics.</a> Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).</li>
<li>Kalyuzhnaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metagenomics+targets+specific+functional+types+in+complex+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).</li>
<li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Something+from+%28almost%29+nothing%3A+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2, 233-241 (2008).</li>
<li>Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+SJ+%22Microbiology+of+Hydrocarbon+and+Lipid+Microbiology%22">Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology</a>. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).</li>
<li>Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Who+eats+what%2C+where+and+when%3F+Isotope-labelling+experiments+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age.</a> ISME J. 1, 103-110 (2007).</li>
<li>Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+shortens+the+incubation+time+needed+to+detect+benzoate-utilizing+denitrifying+bacteria+by+stable-isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

安定同位体プロービング実験の適切な設計は、バックグラウンドラベルのない社会の上に標識されたDNAを得るために非常に重要である。サンプルのインキュベーション時間、基質濃度、インキュベーションの条件（例えば、栄養素、土壌水分の含有量）に関連した考慮事項、栄養共生とレプリケーションが他の場所で10,18議論と我々は、SIPインキュベーションを設計する際に、読者がこれらの出版物に相談することをお奨めしている。現在のプロトコルに関連して、それは、SIPの勾配からのデータの解釈に関連する追加の考慮事項についてコメントする価値がある。超遠心分離プロセスの性質上、それは特定の分画に出現または消えるバンドはプロトコル自体のアーティファクトではないことを保証するような純粋な文化やネイティブ基質インキュベーションのサンプルなどのコントロールを含めることがさらに重要です。例えば、超遠心勾配内のDNAは、アガロースゲル（図2A）に表示されないことがありますが、それでも勾配の全長（図2B）を汚染する可能性があります。もののM. capsulatusのパターンは、図2Bに示すようにゲルの高密度フラクション（5-7）で最も異なっ...

<table><tbody><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP115-25</td><td></td></tr><tr><td>塩化セシウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール（試薬グレード）</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>652261</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>351285212</td><td></td></tr><tr><td>線状ポリアクリルアミド</td><td>試薬</td><td>Applichem</td><td>A6587</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 6000</td><td>試薬</td><td>VWR international</td><td>CAPX1286L-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42409-0010</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2711</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレット</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3181</td><td></td></tr><tr><td>Trisベース</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>ダークリーダー</td><td>機器</td><td>Clare Chemical</td><td>DR46B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>機器</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>機器</td><td>Fisher Scientific</td><td>361013650</td><td></td></tr><tr><td>注入ポンプ</td><td>機器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>N/A</td><td>モデル番号：BSP&lt;br/&gt;注文詳細は &lt;a href=&quot;http://www.braintreesci.com">www.braintreesci.com&lt;/a&gt; を参照してください。</td></tr><tr><td>チューブシーラー</td><td>機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>358312</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機用ローター</td><td>機器</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362754</td><td></td></tr><tr><td>紫外線光源</td><td>機器</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0017-09</td><td>任意のUV光源で代用可能</td></tr><tr><td>紫外線遮蔽フェイスシールド</td><td>機器</td><td>Fisher Scientific</td><td>114051C</td><td></td></tr><tr><td>ブチルゴムストッパー（グレー）</td><td>材料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27232</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ</td><td>材料</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>342412</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射針（23ゲージ、長さ2&amp;#8221;）</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ（1.5 mL）</td><td>材料</td><td>DiaMed</td><td>AD151-N500</td><td></td></tr><tr><td>オープンセンターシール（直径20 mm）</td><td>材料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27230-U</td><td></td></tr><tr><td>パストゥールピペット（ガラス製）</td><td>材料</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6C</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>材料</td><td>DiaMed</td><td>BPS340-1000</td><td>カタログ番号は200 &amp;#x03BC;lチップ用です。10または20 &amp;#x03BC;lチップも同社から購入可能です。</td></tr><tr><td>ポンプチューブ（内径1.5 mm × 壁厚1.5 mm）</td><td>材料</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ（15 mL）</td><td>材料</td><td>DiaMed</td><td>AD15MLP-S</td><td></td></tr><tr><td>セラムバイアル（容量125 mL）</td><td>材料</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114014</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ（60 mL）</td><td>材料</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr></tbody></table>

プロービングdna安定同位体（dna - sip）

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA安定同位体（DNA - SIP）プローブは、細胞バイオマスに特定の炭素基質と栄養素を吸収し、アクティブな微生物を識別するための強力な手法です。このように、この栽培に依存しない手法は、陸域と水域環境の広い範囲に生息する多様なコミュニティへの代謝機能を割り当てるための重要な方法論となっています。安定同位体標識化合物による環境試料のインキュベーションに続いて、抽出した核酸は、異なる密度の核酸を分離する密度勾配超遠心分離とその後の勾配分画に供される。塩化セシウムからのDNAの精製は、その後の分子特性（例えば指紋、マイクロアレイ、クローンライブラリ、メタゲノミクス）のための標識と非標識DNAを取得します。このJoveのビデオプロトコルは密度勾配超遠心分離、勾配分画とラベルされたDNAの回復のためのプロトコルの視覚的なステップバイステップの説明を提供します。プロトコルはまた、サンプルのSIPデータとハイライトの重要なヒントが含まれており、成功したDNA - SIPの分析を確実にするために考慮しなければならないことをご承知おき下さい。

DNA安定同位体プロービングには、特定の基質を利用することのできる微生物の活発なコミュニティを識別し、特徴付けるために栽培に依存しない方法です。重い同位体に富む基板の同化は、微生物バイオマスへの標識原子の取り込みにつながる。密度勾配超遠心分離は、下流の分子解析のための標識DNAを取得します。

プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

DNA安定同位体プローブ法（DNA-SIP）は、特定の炭素基質を取り込む活性微生物を同定するための強力な手法であり、...

本手順の全体的な目的は、ラボでの培養を前提とせず、目的の増殖基質を消費した活性微生物からDNAを回収することです。これは、まず環境サンプルを、自然環境に近い条件下で目的の安定同位体標識基質とともにインキュベートすることで達成されます。手順の第2段階として、この同位体標識サンプルから全DNAを抽出します。本手順の第3ステップでは、このDNAを塩化セシウム密度勾配超遠心法に供します。最終ステップでは、密度勾配を分画し、その後の分子生物学的解析に用いるためのヘビーDNAおよびライトDNAを回収します。最終的に、フィンガープリント法、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、クローン、ライブラリー解析、メタゲノミクスなどの様々な分子生物学的手法を用いることで、特定の基質の代謝に関与しているが未培養である活性微生物の正体を明らかにすることが可能です。こんにちは。ウォータールー大学生物学部のJosh Neufeldです。Neufeld研究室の大学院生のEric Dunfordです。本日は、未知の、あるいは培養が困難な微生物の正体とその特定の増殖基質を利用する能力を結びつける手法として広く用いられている、DNA安定同位体プローブ法（DNA-SIP）の手順についてご紹介します。Newfeld研究室では、さまざまな陸上および水圏環境における炭素源の代謝を研究するために、この手順を用いています。本日は、特定の炭素基質である13 C glucoseを土壌サンプルに適用する方法について説明します。なお、この手法はウォーリック大学のColin Merleらのグループによって最初に開発されて以来、研究者によってプロトコルが多様化され、さまざまな異なる環境への適用や、窒素や酸素などの異なる標識同位体の使用が行われていることを付け加えておきます。本日は炭素に焦点を当てますが、このプロトコル自体は異なる実験計画にも適用可能です。それでは始めていきましょう。この手順を開始する前に、本プロトコルの記述部分に従って、すべてのDNA安定同位体プロービング（DNA SIP）またはDNA CYP試薬を準備してください。DNACはサンプルのインキュベーションから始まります。インキュベーション条件は、サンプルや基質のさまざまな特性に応じて大きく異なります。経験的に適切なインキュベーション条件を決定した後、環境サンプルに適切な基質添加物を加えます。テスト培養に基づき、微生物の増殖に補完的な栄養素が必要な場合は、これらを追加することも可能です。サンプルのインキュベーション準備が整ったら、サンプルにキャップをして密封し、標識基質を含む環境サンプルをインキュベートします。ここで示している例では、土壌サンプルに13C標識グルコース溶液を添加しています。次に、以降のステップで観察される核酸の標識を明確に確認するための比較

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