プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

本手順の全体的な目的は、ラボでの培養を前提とせず、目的の増殖基質を消費した活性微生物からDNAを回収することです。これは、まず環境サンプルを、自然環境に近い条件下で目的の安定同位体標識基質とともにインキュベートすることで達成されます。手順の第2段階として、この同位体標識サンプルから全DNAを抽出します。

本手順の第3ステップでは、このDNAを塩化セシウム密度勾配超遠心法に供します。最終ステップでは、密度勾配を分画し、その後の分子生物学的解析に用いるためのヘビーDNAおよびライトDNAを回収します。最終的に、フィンガープリント法、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、クローン、ライブラリー解析、メタゲノミクスなどの様々な分子生物学的手法を用いることで、特定の基質の代謝に関与しているが未培養である活性微生物の正体を明らかにすることが可能です。

こんにちは。ウォータールー大学生物学部のJosh Neufeldです。Neufeld研究室の大学院生のEric Dunfordです。本日は、未知の、あるいは培養が困難な微生物の正体とその特定の増殖基質を利用する能力を結びつける手法として広く用いられている、DNA安定同位体プローブ法（DNA-SIP）の手順についてご紹介します。

Newfeld研究室では、さまざまな陸上および水圏環境における炭素源の代謝を研究するために、この手順を用いています。本日は、特定の炭素基質である13 C glucoseを土壌サンプルに適用する方法について説明します。なお、この手法はウォーリック大学のColin Merleらのグループによって最初に開発されて以来、研究者によってプロトコルが多様化され、さまざまな異なる環境への適用や、窒素や酸素などの異なる標識同位体の使用が行われていることを付け加えておきます。

本日は炭素に焦点を当てますが、このプロトコル自体は異なる実験計画にも適用可能です。それでは始めていきましょう。この手順を開始する前に、本プロトコルの記述部分に従って、すべてのDNA安定同位体プロービング（DNA SIP）またはDNA CYP試薬を準備してください。

DNACはサンプルのインキュベーションから始まります。インキュベーション条件は、サンプルや基質のさまざまな特性に応じて大きく異なります。経験的に適切なインキュベーション条件を決定した後、環境サンプルに適切な基質添加物を加えます。

テスト培養に基づき、微生物の増殖に補完的な栄養素が必要な場合は、これらを追加することも可能です。サンプルのインキュベーション準備が整ったら、サンプルにキャップをして密封し、標識基質を含む環境サンプルをインキュベートします。ここで示している例では、土壌サンプルに13C標識グルコース溶液を添加しています。

次に、以降のステップで観察される核酸の標識を明確に確認するための比較対象として、コントロール培養をセットアップします。基質キャップに非標識の炭素を使用すること以外は同一の条件でこのサンプルを調製します。環境サンプルを非標識基質とともに密閉し、同一の条件下で培養します。培養後、目的の下流アプリケーションに適した抽出プロトコルを用いて、マイクロコスムからDNAを抽出します。その後、アガロースゲルと分光光度計を用いて、以降の超遠心分離ステップに必要となる抽出DNAの定量を行います。

軽鎖および重鎖DNAを最大限に分離させるため、超遠心分離には垂直またはほぼ垂直のローターを使用してください。Beckman Coulter VTI 65.2ローターには、超遠心分離用サンプルの調製に使用する5.1 milliliterのクイックシールポリマーチューブを保持するための16個のウェルがあります。まず、超遠心分離チューブに0.5からfive microgramsのDNAを添加するために必要な抽出DNAの量を算出します。

あらかじめ決定したDNA濃度を用いてください。次に、デジタル屈折計を使用して塩化セシウムストック溶液の正確な密度を測定します。記載されたプロトコルに従い、適切な混合比を生成するために必要な勾配バッファーDNA溶液の量を算出してください。

これらの計算に基づき、抽出したDNAを勾配緩衝液および4.8 millilitersの塩化セシウムと共に、滅菌済みの使い捨て15 milliliterチューブに合わせます。遠心分離チューブを完全に満たすため、得られる容量はチューブの規定容量よりも多くなります。最後に、チューブを10回反転させて溶液を調製します。このプロトコルのバリエーションをご活用ください。

チューブ内でDNAを可視化するために、勾配溶液中にエチジウムブロマイドのような蛍光剤を使用します。ここに示すように、エチジウムブロマイド勾配を含む純粋培養DNAで調製してDNAの密度を変化させると、各遠心操作後に勾配が形成されたことを即座に視覚的に確認できるため、特に有用です。このようなアプローチを用いた操作手順は、書面によるプロトコルに記載されています。

まず超遠心分離の準備として、バルブ付きピペットを用いて、超遠心管に勾配溶液を慎重に充填します。細字の油性マジックで、チューブのショルダー部分にラベルを貼ります。このとき、チューブをネックの底部まで正確に満たすようにしてください。充填量が不十分なチューブは、超遠心分離中に破損する傾向があるためです。

必要なすべてのチューブにサンプル溶液を満たしたら、各チューブの正確な質量を記録します。チューブをできるだけ近い質量のペアに分け、10 mg以内でバランスが取れるまで、溶液を微量に添加または除去して調整してください。溶液の液面は、できるだけチューブのネックの底部に近づけて保持します。その後、製造元の指示に従ってチューブトッパーを用いてチューブを密封します。

チューブを反転させ、適度な圧力をかけて、適切に密閉されているかを確認します。超遠心分離に先立ち、密閉後のチューブが引き続きバランスしているかを確認するため、再度重量を量ります。各ローターウェルを慎重に点検し、超遠心分離中にチューブを穿孔させる可能性のあるほこりや破片がなく、清潔であることを確認してください。

チューブをローターに挿入し、バランスの取れたペアを互いに向かい合わせて配置します。超遠心分離の過程でマーカーラベルが判読不能になる可能性があるため、各サンプルのローター内位置を記録しておきます。製造元の指示に従い、ローターのウェルを慎重に封印してください。

ローターのウェルを密封したら、ローターを超遠心機にセットします。超遠心機のドアを閉め、VTI 65.2ローターに真空をかけます。回転速度を44,100 RPMに、温度を20 °Cに、超遠心時間を36〜40時間に設定します。

真空状態であることを確認し、最大加速を選択してブレーキをオフにし、減速によって勾配が乱れないようにします。超遠心分離後、直ちにローターを慎重に取り出してください。チューブ内の勾配を乱さないよう、ローターを傾けたりぶつけたりしないように注意してください。

最後に、勾配分画用のチューブを慎重に取り出します。分画法を用いることで、超遠心機チューブからDNAを抽出できます。まず、十分な量のプロポフォールブルー染料を含む滅菌精製脱イオン水を、滅菌済みの60 milliliterシリンジに充填します。

濃い青色にするために、シリンジをシリンジポンプのローディングアームに設置します。次に、23ゲージの1インチ針を装着したポンプチューブを取り付け、針の先端から少量の水が出るまでポンプを作動させます。分画プロセスに悪影響を及ぼすため、給水系に気泡が入らないように注意してください。

サンプルごとに、サンプル番号と分画を記載したラベルを貼った滅菌済みの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブを12本準備します。次に、超遠心チューブの1本を、素早く制御された動作でクランプスタンドに固定します。新品の23 gauge 1 inchの針を用いてチューブの継ぎ目に沿って底面を貫通させ、針を回転させて均一な穴が開いていることを確認します。

ニトリル手袋よりもラテックス手袋の方が、針のシャフトをより確実に保持できる場合があります。ポンプチューブに取り付けられた針を使用し、チューブ上部のショルダー部分にある継ぎ目に沿って、素早く的確に貫通させます。なお、チューブの上部を貫通させた後に下部を貫通させる方法でも可能です。

また、チューブのショルダー部分に少量のミネラルオイルを塗布しておくと、以前に校正したポンプ流量において、上部ニードル周囲のシール不良による漏れを防ぐのに役立ちます。染色した水をチューブ上部から注入し、12分間で12個の425 µL分画を得ます。タイマーを使用して、ラベル付きのマイクロ遠心チューブにグラジエント溶液を回収してください。

最後に、少なくとも1つのサンプルまたはコントロールグラジエントについて、すべてのフラクションの密度を確認します。デジタル屈折計を使用してください。すべてのフラクションからDNAを沈殿させるには、1.690から1.760 grams per milliliterの範囲で、中央値が約1.725 grams per milliliterの密度であることが期待されます。

まず、沈殿剤として線状ポリアクリルアミドを20 micrograms加え、転倒混和します。次に、PEG溶液を2容量分加え、再度転倒混和します。その後、DNAを沈殿させるため、チューブを室温で2時間静置し、インキュベーションを行います。

ペレットの位置を一定にするため、チューブの向きを揃えてサンプルをマイクロ遠心分離機にセットします。13,000 Gで30分間遠心分離した後、サンプルをマイクロ遠心分離機から取り出し、上清を慎重に吸引して廃棄します。この段階で、強い光源を用いればペレットが視認できるはずです。

遠心分離後、ペレットを500 µLの70% ethanolで洗浄します。13,000 ×gで10分間遠心分離し、その後、上清を慎重に吸引して廃棄します。これでペレットがより明確に見えるようになりますが、チューブの壁から離れやすくなるため注意してください。

室温で15分間放置し、ペレットを乾燥させます。ペレットが乾燥したら、各ペレットを50 µLのTEバッファーに懸濁します。最後に、各フラクションを5 µLずつアガロースゲルで電気泳動し、記載されたプロトコルで述べられている手法を用いて、勾配フラクションの特性評価を行います。

典型的なDNA SIPの結果では、超遠心分離による密度勾配内で、標識DNAと未標識DNAの分離が示されます。理想的には、$^{13}$Cや$^{15}$Nなどの高分子量遺伝物質が未標識物質から完全に分離され、特に安定同位体で培養したサンプルの画分4から8において、天然基質では見られないPCRベースの特異的なフィンガープリントが得られます。2つの純粋培養株である$^{13}$C標識Methylococcus capsulatus strain Bathおよび未標識Cyanothece sp. ATCC 29148のDNAを用いて培養コントロール試験を行った場合、標識および未標識のゲノムDNAが密度の異なるそれぞれの勾配画分に分離するため、特定の微生物と特定の標識基質の代謝を結びつける強力な証拠となります。

この例では、重同位体標識DNAが画分4から5で観察される一方、未標識DNAは画分9から10に高濃度で存在しています。同一画分からPCR増幅したDNAを、変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）に供したところ、勾配に含まれる2つの生物に対応する独立したバンドパターンが得られました。各画分の密度は、約1.580から1.759 grams per milliliterの範囲であり、左から右に向かって密度の低い順に示されています。

逆に、同位体の分離および環境試料の培養は、解釈がより困難な場合があります。カナダのレゾリュート湾から採取したツンドラ土壌を、炭素12または炭素13で標識したグルコースとともに、15 °Cで14日間培養しました。精製された勾配分画DNAのアガロースゲルでは、炭素12および炭素13の両方の培養において、分画7から10にかけてゲノムDNAのスメアが認められました。

しかしながら、特定の微生物タクサからのバイオマスにおける炭素13濃縮度を決定するために16 s ribosomal RNA遺伝子のDGGEを用いたところ、炭素12グルコースで培養した土壌由来のDNAはすべての勾配分画において同様のパターンを示しましたが、炭素13グルコースで培養した試料は分画5から8に特異的に関連するDGGEフィンガープリントを生成しました。矢印で示された保存的なバンドは、すべての勾配分画にわたって共通する優占的なフィロタイプを表しています。炭素13グルコースで培養した土壌から得られたDNAでは、フィロタイプがより重い分画へとシフトしています。この特定の16 s ribosomal RNA遺伝子の同一性を決定することで、その後のメタゲノム解析や培養ベースのアプローチの指針とすることができます。

サンプルの培養から分子解析用の標識DNAの回収まで、DNA安定同位体プローブ法（DNA-SIP）実験の実施方法について説明しました。この手順を行う際は、実験計画を慎重に検討することが重要です。特に、速やかに増殖する生物に実験結果が偏るのを防ぐため、基質を添加しすぎないよう注意してください。また、食物網を通じて基質がコミュニティの他の構成員に拡散することを避けるため、長時間の培養は控えてください。

感度の高いPCRベースのアプリケーションを用いて、ヘビーフラクション中の少量の標識DNAを検出するために、最適な量の基質と十分なインキュベーション時間を設定する方法について解説しました。以上になります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。