プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

この手順の全体的な目標は、実験室での培養の前提条件なしに、目的の増殖基質を消費した活性微生物からDNAを回収することです。これは、まず、天然環境と同様の条件下で、目的の安定同位体標識基質と環境サンプルをインキュベートすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、この同位体標識サンプルから全DNAを抽出することです。

手順の3番目のステップは、このDNAを塩化セシウム中で密度勾配超遠心分離にかけることです。手順の最後のステップは、密度勾配を分画して、その後の分子特性評価のために重いDNAと軽いDNAを取得することです。最終的には、フィンガープリント、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、クローン、ライブラリ解析、メタゲノミクスなど、さまざまな分子技術を通じて、特定の基質の代謝に関与する活性でありながら培養されていない微生物の同一性を明らかにする結果を得ることができます。

こんにちは、ウォータールー大学生物学部のジョシュ・ニューフェルドです。私はエリック・ダンフォード、ニューフェルド研究所の大学院生です。今日は、未知で未培養の可能性のある微生物の同一性と、目的の成長基質を使用する能力を結びつけるために広く使用されている技術となったDNA同位体プローブ、またはDNAシップの手順をご紹介します。

ニューフェルド研究室では、この手順を使用して、さまざまな陸生および水生環境における炭素源の代謝を研究しています。今日は、特定の炭素基質である13Cグルコースを土壌サンプルに応用する方法をご紹介します。しかし、この方法がウォーリック大学のColin Merleのグループによって最初に開発されて以来、研究者はプロトコルを多様化してさまざまな異なる環境に適用し、窒素や酸素などのさまざまな標識同位体も使用してきたことを認識しています。

今日は炭素に焦点を当てますが、プロトコル自体はさまざまな実験デザインに適用できます。それでは始めましょう。この手順を開始する前に、このプロトコルの書面による部分に記載されているように、すべてのDNA安定同位体プローブまたはDNA CYP試薬を準備します。

DNACはサンプルのインキュベーションから始まります。インキュベーション条件は、さまざまなサンプルや基質の特性によって大きく異なります。適切なインキュベーション条件が経験的に決定されたら、環境サンプルに適切な基質修正剤を添加します。

また、試験インキュベーションに基づいて必要な場合は、微生物の増殖を可能にするための補助栄養素を含めることもできます。サンプルインキュベーションを設定したら、サンプルにキャップをして密封し、標識された基質を含む環境サンプルをインキュベートします。示されている例は、土壌サンプルに炭素13標識グルコース溶液を添加することを含む。

次に、後続のステップで観察された核酸の見かけの標識を確認するための比較として機能するコントロールインキュベーションを設定します。このサンプルは、基質キャップとして非標識カーボンを使用する以外は同じ条件下で調製し、インキュベーション抽出物、小宇宙からのDNAに続く同じ条件下で、環境サンプルを非標識基質と密封してインキュベートします。次に、抽出したDNAを次の超遠心分離ステップで、オースゲルと分光光度計を使用して定量します。

超遠心分離には垂直または垂直に近いローターを使用して、軽いDNAと重いDNAを最大限に分離します。ベックマン・コールターVTI 65.2ローターには、超遠心分離用のサンプルを調製するための5.1ミリリットルのクイックシールポリマーチューブを保持するための16個のウェルがあります。まず、0.5〜5マイクログラムのDNAを超遠心チューブに加えるために必要な抽出DNAの量を計算します。

以前に決定されたDNA濃度を使用します。次に、デジタル屈折計を使用して、塩化セシウムストック溶液の正確な密度を決定します。書面によるプロトコルで提案されているように、適切な混合比を生成するために必要なグラジエントバッファーDNA溶液の量を計算します。

これらの計算を使用して、抽出したDNAをグラジエントバッファーと4.8ミリリットルの塩化セシウムを滅菌済みの使い捨て15ミリリットルチューブに組み合わせます。結果として得られる容量は、チューブを完全に満たすために、遠心分離チューブの指定された容量よりも大きくなります。最後に、このプロトコルの10倍のバリエーションでチューブを反転させることにより、溶液を作成します。

グラジエント溶液内でahyや臭化物などのフローラフォースを使用して、チューブ内でDNAを視覚化できるようにします。ここに示すようにAUM臭化物グラジエントを含む純粋な培養DNAで調製した場合にDNAの密度を変更することは、各遠心分離機後のグラジエント形成を即座に視覚的に確認するために特に有用です。このようなアプローチを使用した実行手順については、記述されたプロトコルで説明されています。

最初に超遠心分離をセットアップするには、バルブを使用し、ピペットを通して、超遠心チューブにグラジエント溶液を慎重に充填します。チューブショルダーのチューブに細かい油性マーカーでラベルを付けます。充填が不十分なチューブは超遠心分離中に破裂する傾向があるため、チューブがチューブネックの基部まで正確に充填されていることを確認してください。

必要なすべてのチューブにサンプル溶液が充填されたら、各チューブの正確な質量を記録し、チューブを厳密に一致するペアとして分類し、10ミリグラム以内にバランスが取れるまで新しい量の溶液を追加または削除します。次に、溶液をチューブの底面にできるだけ近づけてレベルに保ちます。次に、製造元の指示に従ってチューブトッパーを使用してチューブを密封します。

チューブを反転させ、適度な圧力を加えて、チューブが適切に密閉されていることを確認します。チューブの重量を再度測定して、超遠心分離前にシールした後もチューブのバランスが取れていることを確認します。各ローターを慎重に検査して、超遠心分離中にチューブに穴を開ける可能性のあるほこりや破片がなく、清潔であることを確認してください。

チューブをローターに挿入し、バランスの取れたペアを互いに反対側に配置します。超遠心分離プロセスによりマーカーラベルが読みやすくなるため、各サンプルのローター位置を記録します。メーカーの指示に従って、ローターウェルを慎重に密封します。

ローターウェルが密閉されたら、ローターを超遠心分離機にロードします。超遠心分離機のドアを閉じ、VTI 65.2ローターに真空を塗布します。回転速度を44、100 RPM、温度を摂氏20度、超遠心分離時間を36〜40時間に設定します。

バキュームがオンになっていることを確認し、最大加速を選択し、ブレーキをオフにして、減速によって勾配が乱れないようにします。超遠心分離の直後に、ローターを慎重に取り外してください。チューブ内の勾配を乱さないように、ローターを傾けたりぶつけたりしないように注意してください。

最後に、グラジエント分画のためにチューブを静かに取り外します。DNAは、分画技術を使用して超遠心チューブから抽出できます。まず、滅菌済みの60ミリリットルシリンジに、十分なプロポフォールブルー色素を含む滅菌蒸留脱イオン水を入れます。

ダークブルーの色にするには、シリンジをシリンジポンプのローディングアームに置きます。次に、23ゲージの1インチ針を取り付けたポンプチューブを取り付け、針の端から水が出るまでポンプをオンにします。給水に気泡が入ると、分別プロセスに悪影響を与えるため、避けてください。

各サンプルについて、サンプル番号と画分を示すラベル付きの滅菌済み1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを12本調製します。次に、超遠心分離チューブの1つをクランプスタンドに素早く制御された動きで固定します。新しい23ゲージの1インチの針を使用してチューブの継ぎ目に沿ってチューブの底を突き刺し、針を回転させて均一な穴が形成されていることを確認します。

ラテックス手袋は、ニトリル手袋よりも針軸のグリップが優れていることに気付くかもしれません。ポンプチューブに取り付けられている針を使用して、継ぎ目に沿ってチューブの上部を上部チューブの肩に素早く制御された方法で突き刺します。チューブの上部に続いてチューブの下部に穴を開けることもできます。

また、チューブのショルダーをコーティングする少量の鉱油は、以前に校正されたポンプ速度で上部針の周りの不適切なシールによる漏れを防ぐのに役立つことに注意してください。染色した水をチューブの上部にポンプで送り込み、12分で12,425マイクロリットルのフラクションを生成します。タイマーを使用して、標識されたマイクロ遠心チューブ内のグラジエント溶液を回収します。

最後に、少なくとも1つのサンプルまたはコントロールグラジエントについて、すべてのフラクションの密度を確認します。デジタル屈折計を使用。1ミリリットルあたり1.690〜1.760グラムの範囲の値、中央値の密度がミリリットルあたり約1.725グラムの場合、すべての画分からDNAが沈殿することを期待してください。

まず、沈殿の担体として20マイクログラムの直鎖状ポリアクリルアミドを加え、反転して混合します。次に、2容量のPEG溶液を加え、再度、反転して混合します。チューブを室温で2時間放置し、インキュベーション後にDNAを沈殿させます。

サンプルをマイクロ遠心分離機に入れ、チューブを同じ方向に向けて、ペレット遠心分離機の一貫した位置特定を確保します。遠心分離後30分間13, 000 Gのチューブでマイクロ遠心分離機からサンプルを取り出し、その後、スーパーナットアプリを慎重に吸引して廃棄します。ペレットは、明るい光源の助けを借りて、この段階で見えるはずです。

ペレット遠心分離機を洗浄した後、500マイクロリットルの70%エタノールでペレットを洗浄します。遠心分離後10分間、13, 000 Gのサンプルを慎重に吸引し、スーパーネイトを廃棄します。ペレットは見やすくなりますが、チューブ壁からより簡単に解離します。

ペレットを室温で15分間乾燥させます。ペレットが乾燥したら、各ペレットを 50 マイクロリットルの TE バッファーに懸濁します。最後に、各画分の5マイクロリットルをエアロスゲル上で泳動し、書面によるプロトコルで説明されている方法を使用してグラジエント画分を特徴付けます。

典型的なDNA SIPの結果は、超遠心分離によるグラジエント形式での標識DNAと非標識DNAの分離を示しています。理想的には、炭素13や窒素15などの高分子量遺伝物質が非標識材料から完全に分離され、特に安定同位体インキュベートされたサンプルの画分4〜8に関連する独自のPCRベースのフィンガープリントが得られますが、天然基質とは分離されません。インキュベートコントロールは、2つの純粋な培養物、炭素13標識メチルoccusカプセル炎菌槽および非標識Sian medi A TCC 10 21(標識されていないゲノムDNAを標識)からのDNAに対して実行した場合、特定の生物と特定の標識基質の代謝を関連付ける強力な証拠を提供します。

この例では、重同位体標識DNAは4〜5の画分で観察できますが、非標識DNAは9〜10の画分で高濃度で観察されます。同じ画分からPCR増幅されたDNAを、変性およびグラジエントゲル電気泳動またはDGGEを使用して実行し、グラジエントに含まれる2つの生物に対応する個別のバンディングパターンを生成しました。フラクションの密度は、ミリリットルあたり約1.580〜1.759グラムの範囲であり、左から右に密度が減少する順に示されています。

逆に、同位体と環境サンプルインキュベーションの分離は、解釈がより困難になる可能性があります。カナダのレゾリュート湾のツンドラ土壌を、炭素12または炭素13で標識されたグルコースと摂氏15度で14日間インキュベートしました。精製されたグラジエント画分DNAのエアロスゲルは、炭素12および炭素13のインキュベーションの両方について、画分7から10にわたってスメアゲノムDNAを明らかにしました。

しかし、16 s リボソーム RNA 遺伝子の DGGE を使用して、特定の微生物分類群からのバイオマスの炭素 13 濃縮を決定した場合、炭素 12 グルコースインキュベート土壌、DNA はすべての勾配画分で同様のパターンを生成し、炭素 13 グルコースインキュベート サンプルは、画分5 から 8 に一意に関連する DGG フィンガープリントを生成しました。 矢印で示された保存されたバンドは、すべての勾配分画で一貫した主要な系統タイプを表していました。phylo タイプは、Carbon 13 グルコースインキュベート土壌から得られる DNA のより重い画分にシフトします。この特定の16 sリボソームRNA遺伝子の同一性は、その後のメタゲノムまたは培養ベースのアプローチを導くために決定することができます。

インキュベーションから分子分析用の標識DNAの取得まで、DNA安定同位体プロービング実験を行う方法を紹介しました。この手順を実行するときは、実験計画を慎重に検討し、急速に成長する生物に実験を偏らせないように、基質を追加しすぎないように注意することが重要です。また、食物網を通じてコミュニティの他のメンバーに基質が希釈されないように、インキュベーションの延長は避けたいと考えています。

そのため、適切な量の基質と十分なインキュベーション時間を使用して、高感度のPCRベースのアプリケーションで重い画分中の少量の標識DNAを検出できるようにしたいと考えています。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。