0 閲覧数 • 4:57 分 • April 30th, 2023
- 転写因子は、DNA上の特定の部位に結合して遺伝子発現を調節するタンパク質です。転写因子のエラーはこの活性を変化させ、遺伝子の過剰発現を引き起こし、がんを引き起こします。転写因子の役割と遺伝子制御を理解するために、クロマチン免疫沈降アッセイまたはCHIPを実施することができますが、クロマチンシアリングはCHIPワークフローの重要なステップです。
クロマチン剪断には、ホルムアルデヒドを添加してDNA-タンパク質複合体を安定化させます。ホルムアルデヒドは、共有結合を形成することにより、タンパク質を関連するDNA配列に架橋します。次に、適切な溶解バッファーを使用して細胞を溶解し、架橋されたDNA-タンパク質複合体を含むクロマチンを放出し、遠心分離します。ミクロコッカスヌクレアーゼ酵素を用いてクロマチンを剪断します。この酵素は、ヌクレオソーム間のクロマチンを切断し、緩いDNA末端を消化します。混合物を遠心分離し、上清を回収します。
上清をTBEアガロースゲルにロードして、DNA断片の適切なサイズを分析します。ゲル全体に電界を印加すると、負に帯電したクロマチンDNAがアノードに向かって移動します。小さなフラグメントはゲルのさらに下に移動します。せん断されたクロマチンは、ゲル中に塗抹標本として現れます。次のプロトコルでは、超音波処理を使用して慢性骨髄性白血病細胞株のクロマチンを剪断します。
- まず、1.5ミリメートルのチューブに1ミリリットルの37%ホルムアルデヒドを満たします。次に、別の1.5ミリリットルのチューブに1ミリリットルの1.25モルグリシンを充填し、5ミリリットルのチューブに4ミリリットルのPBSを入れます。次に、細胞の刺激後、テキストプロトコルに従って細胞を回転させ、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、チューブを氷で満たされたボックスに入れます。13.5マイクロリットルの37%ホルムアルデヒドを細胞に加え、ピペッティングで上下させて混合します。
次に、懸濁液を室温でインキュベートします。この後、57マイクロリットルの1.25モルグリシンを加えて固定を停止し、この懸濁液を室温で5分間インキュベートします。インキュベーション期間の直後に、細胞を氷の上に置き、細胞を500倍gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、上清を吸引します。次に、細胞を氷冷PBS1ミリリットルで200倍gで4°Cで5分間2回洗浄し、上清を取り除きます。ピペッティングを上下させて、細胞ペレットを5ミリリットルの溶解緩衝液-1に再懸濁します。
次に、サンプルを氷の上に置き、10分間振とうしながらインキュベートします。この後、チューブを500 gで摂氏4度で5分間遠心分離します。次に、ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。5ミリリットルの溶解緩衝液-2で細胞をホモジナイズし、ピペットで上下に動かして混合します。その後、細胞を氷上で振とうしながら10分間インキュベートします。インキュベーション期間終了後、チューブを500 gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
次に、細胞ペレットを1Xプロテアーゼ阻害剤を含むせん断緩衝液-1に再懸濁します。次に、細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。140マイクロリットルの細胞懸濁液をソニケーターチューブに移し、気泡が形成されないように注意します。チューブを7°Cの集束超音波装置に入れ、10〜7分半せん断します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。サンプルを15,700 gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに回収します。