JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 6:29 分 • April 30th, 2023
- クロマチン免疫沈降法(ChIP)は、細胞内のタンパク質-DNA相互作用を決定するために使用される技術です。タンパク質はDNA上の特定の部位に結合し、遺伝子発現を調節します。まず、ホルムアルデヒドでDNA-タンパク質複合体を安定化させます。ホルムアルデヒドは、共有結合を形成することにより、タンパク質を関連するDNA配列に架橋します。
次に、適切な溶解バッファーを使用して細胞を溶解し、架橋されたDNA-タンパク質複合体を含むクロマチンを放出します。懸濁液を遠心分離し、上清を超音波処理してクロマチン断片を得る。その後、DNA結合タンパク質に特異的に結合する適切な抗体でサンプルを標識します。
特殊な磁気ビーズをサンプルに加えます。ビーズは抗体を認識し、それに結合します。磁石を使用して、抗体-タンパク質-DNA複合体を含む磁気ビーズを収集します。サンプルを洗浄して、結合していないクロマチンまたは抗体を除去します。複合体に高塩濃度のバッファーを添加し、より高い温度でインキュベートしてDNAタンパク質の架橋を逆転させます。
磁石を使用して、DNAとタンパク質を含む上清を収集します。プロテイナーゼK酵素を添加して、サンプル中のタンパク質を分解します。DNAを沈殿させるための適切なバッファーを添加し、さらなる分析に使用します。次のプロトコルは、慢性リンパ性白血病細胞におけるクロマチン免疫沈降を実証し、NFAT2標的遺伝子を同定します。
- まず、1.5ミリリットルのチューブ1本に、各沈殿物に対して20マイクロリットルのプロテインAコーティングビーズを調製します。ビーズを磁気ラックに1分間沈殿させ、上清を取り除きます。次に、プロテインAコーティングビーズ20マイクロリットルごとに40マイクロリットルの1x ChIPバッファー1で、ピペッティングで上下してビーズを洗浄します。
ビーズを磁気ラックに1分間沈殿させ、上清を取り除きます。この洗浄プロセスをさらに3回繰り返してから、ビーズを元の容量の1x ChIPバッファー1に再懸濁します。BSA、プロテアーゼ阻害剤、5x ChIPバッファー、およびChIP-seqグレードの水をビーズに加えます。次に、せん断したクロマチンを加えます。
10マイクログラムの抗NFAT2抗体を使用してNFAT2を捕捉し、2.5マイクログラムのIgG抗体をコントロールとして使用します。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、6RPMで回転するホイール上でインキュベートします。翌日、チューブを7,000 gで5秒間回転させ、磁気ラックで1分間インキュベートします。
次に、上清を吸引し、ビーズを洗浄バッファー1、2、3、および4で1回連続して洗浄します。チューブを7,000 gで5秒間回転させてから、磁気ラック上でチューブを1分間インキュベートします。この後、上清を取り除き、次の洗浄バッファーを追加します。
最後の洗浄後、チューブを7,000倍gで5秒間回転させ、磁気ラック上でチューブを1分間インキュベートします。上清を取り除き、100 μLの溶出バッファー1にビーズを取り込みます。次に、回転ホイールでチューブを30分間インキュベートします。
次に、チューブを短時間回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、4マイクロリットルの溶出バッファー2を加えます。インプットコントロールを作成するには、1マイクロリットルのせん断クロマチンを99マイクロリットルの溶出バッファー1および4マイクロリットルの溶出バッファー2と混合します。次に、サンプルを振とうしながら摂氏65度で4時間インキュベートします。
この後、100マイクロリットルの100%イソプロパノールをチューブに加えます。サンプルをボルテックスし、7,000 gで5秒間回転させます。次に、各サンプルに10マイクロリットルの磁気ビーズを追加します。サンプルをボルテックスし、回転するホイール上で室温で1時間インキュベートします。
次に、チューブを短時間回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を吸引し、ビーズを100マイクロリットルの洗浄バッファー1に再懸濁します。チューブを反転させて混合し、室温で回転するホイールで5分間インキュベートします。次に、チューブを短時間遠心分離します。それらを磁気ラックに1分間置き、ピペットを使用して上清を取り除きます。
次に、100マイクロリットルの洗浄バッファー2を追加します。チューブを反転させて混合し、室温で回転するホイールで5分間インキュベートします。この後、チューブを短時間遠心分離し、磁気ラックに1分間置きます。洗浄バッファー2を吸引して除去し、ビーズを55マイクロリットルの溶出バッファーに再懸濁します。
沈殿したDNAを溶出させるには、サンプルを回転ホイールで室温で15分間インキュベートします。この後、チューブを短時間回転させ、磁気ラックに1分間置きます。最後に、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。