0 閲覧数 • 5:21 分 • April 30th, 2023
- 造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、自己複製してさまざまな種類の血液細胞に分化することができます。HSPCは生涯にわたって徐々にDNA変異を蓄積し、これが白血病の一因となる可能性があります。このような突然変異を解析するために、HSPCは通常、骨髄から生成されます。
まず、蛍光色素標識抗体を単核細胞(骨髄から単離された成体幹細胞)に添加し、所望の期間インキュベートします。抗体は、CD34などの特定の細胞表面マーカーに結合します。次に、蛍光活性化細胞サイトメトリーまたはFACSマシンに混合物をロードします。
蛍光色素標識抗体は、レーザーが当たると蛍光を発します。個々の細胞滴は、蛍光強度を測定する検出器を通過し、それに基づいて液滴は電荷を持っています。電磁界の存在下では、正に帯電したセルは負の容器に移動し、その逆も同様です。
次に、FACSでソートされたCD34陽性HSPCを適切な培地で、クローンが見えるまで所望の期間増殖させます。次に、激しいピペッティングと遠心分離機でクローンを取り出し、細胞をペレット化します。クローンHSPCを含むペレットは、さらなる分析のために摂氏マイナス20度で保管してください。次のプロトコルでは、単核細胞からHSPCクローンを生成します。
- この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、サンプル材料と染色の準備から開始します。次に、25ミリリットルの造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)培地を調製します。384ウェルの細胞培養プレートに、各ウェルに75マイクロリットルのHSPC培地を充填します。外側のウェル内の培地の蒸発を防ぐために、外側のウェルに75マイクロリットルの滅菌水またはPBSを入れ、これらのウェルを細胞の選別に使用しないでください。
生存シグナルHSPCの正しい選別は、このプロトコルの最も重要なステップです。染色サンプルから10,000個の細胞の未染色コントロールに基づいてHSPCソーティングのゲートを設定します。線形前方散乱高さと前方散乱面積の割合の周囲にゲートを描画することにより、単一セルをゲートします。
染色されていないコントロール画分を使用して、系統画分のゲートを描きます。CD34陽性細胞のゲートを描画し、CD38陰性、CD45RA陰性細胞の特異的ゲートを設定することにより、このサブセットをさらに特徴付けます。384ウェルプレートをFACSマシンにロードし、単一細胞をソーティングします。FACSマシンに適用可能な場合は、インデックスソートデータを保持するオプションをオンに切り替えて、ソートされたセルの再トレースを有効にします。
単独で選別した造血幹細胞を培養するには、384ウェル培養プレートを蓋付きの透明なポリエチレンラップで包みます。384ウェルプレートを5%の二酸化炭素を入れた加湿した摂氏37度のインキュベーターに移し、目に見えるクローンが現れるまでインキュベーターに3〜4週間保管します。4週間の培養後、どのウェルの合流度が30%以上かを判断します。
各クローンについて、1.5mmマイクロチューブにPBS中の1mlの1%BSAをプレフィルし、対応するウェルに従ってチューブを標識します。ピペットチップに付着する細胞の数を最小限に抑えるために、PBS中の1% BSAでピペットチップを事前に濡らします。75マイクロリットルにセットされた200マイクロリットルのピペットでウェルの底をこすりながら、培地を少なくとも5回激しくピペットで上下させます。
ウェルに対応する標識マイクロチューブに細胞懸濁液を回収します。最大75マイクロリットルの新鮮な1% BSAおよびPBSをウェル内でピペッティングし、細胞の取り込みを最大化します。クローン培養細胞は、ウェルの底にくっつくことができます。標準的な倒立型光学顕微鏡を使用してウェルを検査し、すべての細胞が収集されたかどうかを確認します。
コンフルエント度が30%を超えるすべてのウェルが回収された場合は、384ウェルプレートをインキュベーターに戻します。クローン培養物は、最大5週間増殖する可能性があります。細胞懸濁液を350倍gで5分間スピンダウンします。小さなペレットが見えているはずです。上清の約5マイクロリットルを除くすべての上清を慎重に取り除きます。.細胞ペレットはマイナス20°Cで凍結し、DNA単離の前に数ヶ月間保存することができます。