磁気活性化細胞ソーティング:c-kit陽性細胞を単離する方法

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- c-Kit(CD117)は、骨髄および血液中に存在する造血幹細胞または前駆細胞によって発現されるチロシンキナーゼ膜貫通受容体です。また、急性骨髄性白血病を検出するためのマーカーでもあります。

c-Kit陽性細胞を単離するには、マウスの脚の骨を採取し、それらを粉砕して骨髄を内部から放出します。骨髄懸濁液をろ過して、骨片を取り除きます。骨髄細胞を含む濾液を密度勾配培地に重ね合わせ、遠心分離して単核細胞を他の画分から分離します。

単核細胞の濁った層を、抗CD117マウス抗体に結合したマイクロビーズを含むチューブに集めます。抗体-ビーズ複合体がc-Kit陽性細胞上のCD117受容体に結合するまでインキュベートします。インキュベートした懸濁液を磁場中に置かれた磁気カラムに通します。磁気マイクロビーズで標識されたすべてのc-Kit陽性細胞はカラムに残り、標識されていない細胞は通過します。

カラムを磁場から取り出し、適切なバッファーを使用して内容物をフラッシュし、c-Kit陽性細胞を溶出します。次のプロトコルでは、トランスジェニックマウスの骨髄からのc-Kit陽性細胞の単離を示します。

- まず、安楽死させたマウスから脚の骨を採取します。メスで骨から組織をきれいにします。次に、骨を氷の上の冷たいPBSに入れ、乳棒で骨をつぶします。この後、細胞懸濁液を70μmの細胞ストレーナーでろ過し、10mlピペットで50mlのスクリューキャップチューブに入れます。乳鉢と乳棒を冷たいPBSで複数回洗い、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに加えます。

次に、骨髄を遠心分離し、真空ピペットとガラスピペットで上清を取り除きます。細胞ペレットを5ミリリットルのPBSに再懸濁します。ピペットを使用して、懸濁した骨髄を室温のポリスクロースの上部にゆっくりと加えます。

この後、ブレーキを切った状態でポリスクロースを400Gで20分間回転させます。セトリフュージング後、曇った全単核細胞界面をピペットで採取し、新しい15ミリリットルチューブに移します。PBSで容量を10ミリリットルにし、カウントのために20マイクロリットルを取り出します。

セトリフュージング後、上清を捨て、ペレットを氷の上に置きます。次に、細胞ペレットをEDTAおよびBSAを用いてPBSに再懸濁します。CD117マイクロビーズを細胞懸濁液に加え、ボルテックスして混合します。この後、懸濁液を摂氏4度で10分間インキュベートします。次に、EDTAとBSAを使用してPBSを増やして容量を10ミリリットルまで上げ、摂氏4度で1,200Gで5分間遠心分離します。

真空を使用して上清を除去し、EDTAおよびBSAを含むPBSに細胞ペレットを懸濁します。次に、磁気カラム付きのマグネットスタンドにEDTAとBSAを含むPBSを3ミリリットル加え、収集チューブに流し込みます。バッファーがカラムを通過し終えたら、セル懸濁液を添加し、カラムを通ってコレクションチューブに流します。

次に、EDTAおよびBSAを含むPBSをさらに5ミリリットルカラムに追加し、プランジャーですぐに洗い流します。プランジャーを取り外し、フラッシュを繰り返してからセルをカウントします。細胞を遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットを完全なIMDMに懸濁して培養します。細胞を摂氏37度で一晩培養し、5%の二酸化炭素を含ませます。

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最終更新:1 8月 2026