0 閲覧数 • 4:59 分 • April 30th, 2023
- レトロウイルスは、逆転写酵素を使用してRNAゲノムを二本鎖DNAに変換し、宿主ゲノムに永続的に統合することで複製するRNAウイルスです。新しいウイルス粒子が細胞から出て、他の細胞に感染する可能性があります。がん遺伝子治療は、レトロウイルスベクターを用いて、形質導入と呼ばれる技術によって治療用遺伝子を標的細胞に導入し、変異した遺伝子をダウンレギュレーションしたり、細胞を排除したりします。
高力価のレトロウイルスベクターを得るには、目的のレトロウイルスプラスミド、パッケージングプラスミド、および適切なトランスフェクション剤を含むトランスフェクション混合物をHEK 293細胞にトランスフェクションします。細胞をインキュベートします。トランスフェクション剤は、両方のプラスミドの細胞内への送達を促進します。
レトロウイルスプラスミドは標的遺伝子でウイルスゲノムをコードし、パッケージングプラスミドはウイルスエンベロープタンパク質をコードします。パッケージング細胞の細胞機構は、レトロウイルス粒子を形成し、それらを培地に放出します。ウイルス上清を採取し、遠心分離機で細胞を除去します。
必要な濃度のウイルス粒子とがん細胞をフィブロネクチンコーティングされた培養プレートに移し、ウイルスエンベロープタンパク質の細胞への結合を促進します。細胞をインキュベートします。細胞を採取し、フローサイトメトリーを実施して、形質導入効率を解析します。このプロトコルは、c-Kit陽性マウス骨髄細胞のレトロウイルス媒介形質導入を行います。
- まず、レトロウイルスプラスミドDNAをパッケージングプラスミド、塩化カルシウム、および水を1.5ミリリットルのチューブに組み合わせます。次に、500マイクロリットルのHBSを別の1.5ミリリットルのチューブに追加します。トランスフェクション混合物をHBSの入ったチューブに滴下すると同時に、ボルテクサーを最低設定にして混合します。
トランスフェクション混合物を室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベーション期間中は、HEK細胞にクロロキンを添加し、インキュベーターに保管します。トランスフェクションミックスを添加した後、摂氏37度、5%CO2インキュベーターで細胞を8時間インキュベートし、14ミリリットルの新鮮なDMEM 10培地を非常にゆっくりと添加して細胞培地を交換します。ディッシュの壁に対してゆっくりとピペッティングすることで、HEK細胞の剥離を防ぐことができます。
次に、細胞を摂氏37度、5%CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。10ミリリットルの注射器を使用して、ウイルス上清を収集します。.次に、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターをシリンジに取り付けます。ウイルス上清を新しい収集チューブに沈めます。約16時間後にウイルス上清を回収します。.
この後、PBS中の2ミリリットルの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントを未処理の6ウェル培養プレートに加えます。翌日、ピペットを使用してプレートからフィブロネクチンを取り除きます。プレートをPBS中の2% BSAでブロッキングし、プレートを室温で30分間インキュベートします。
真空機を使用してBSAを除去し、プレートをPBSで洗浄してから、真空機で取り除きます。この後、すぐにろ過したウイルス上清を加え、プレートを2時間遠心分離します。真空を使用して上清を取り除き、プレートを再度回転させます。
次に、上清を真空で取り除き、ウイルスでコーティングされたウェルをPBSで洗浄します。掃除機でPBSを取り外します。以前に培養したc-Kit +マウス細胞をウイルスコーティングウェルに加えます。遠心分離後、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。形質導入の48時間後、遠心分離により細胞をペレット化し、FACSバッファー番号1に再懸濁します。