細胞外プリン代謝:白血病細胞におけるアデノシン生成と代謝を測定するためのHPLCベースのアッセイ

- アデノシンは、細胞外空間に公称濃度で存在するプリンヌクレオシドであり、生理学的条件下での細胞増殖の抑制に役立ちます。白血病のような病的状態では、細胞外アデノシン濃度が増加し、がん細胞に対する免疫応答を阻害します。アデノシンの蓄積は、ATPまたはADPヌクレオチドの脱リン酸化、またはアデノシンのイノシンヌクレオシドへの分解障害のいずれかに起因します。

アデノシンの生成と消費を測定するには、ヌクレオチド基質の存在下でがん細胞を培養します。細胞のアデノシン代謝活性は、培養物中に存在するさまざまなプリン分子の濃度を決定します。遠心分離機で細胞を取り出し、上清中にプリン分子を採取します。

プリン体を分離して定量するには、サンプルを適切なバイアルに移します。逆相、高速液体クロマトグラフィー、または疎水性リガンドを固定化した固定相を含むRP-HPLCカラムにロードします。カラムを通過する間、疎水性分子は配位子に吸着し、その疎水性に基づいて保持されます。最も疎水性の低い分子が最初に流出し、より多くの疎水性分析物が最後に溶出します。

HPLC クロマトグラムで各分析種のピーク特性を調べると、サンプル内の濃度を特定するのに役立ちます。このプロトコールでは、RP-HPLC技術を使用して、慢性リンパ性白血病細胞の細胞外プリン代謝を定量化します。

- AMPの消費とアデノシンおよびイノシンの生成をテストするには、250マイクロリットルの無血清培地に200万のCD19陽性、CD5陽性CLL細胞を再懸濁し、48ウェルプレートで細胞をプレートします。250 マイクロリットルの 400 マイクロモル AMP または AMP と阻害剤を添加して、最終濃度 200 マイクロモル AMP を得ます。ブランクサンプルとして使用する基質がない場合の条件を含めます。

摂氏37度で30〜60分インキュベートします。インキュベーション時間の終わりに、冷たい微量遠心チューブに500マイクロリットルの上清を収集します。直ちにGの17,000倍、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、HPLCランのサンプル調製に進むか、すぐに摂氏マイナス80度で保存します。阻害剤による前処理とAMP基質とのインキュベーションに続いて、0.2ミクロンのシリンジフィルターで新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブで上清をろ過します。ろ過には1ミリリットルの注射器を使用してください。

HPLCシステムにオートサンプラーが付属している場合は、HPLC用のガラスバイアルを準備し、少量のサンプルには100マイクロリットルのマイクロインサートを使用します。マイクロピペットまたはガラスパスツールピペットを使用して、ガラスバイアルに少なくとも100マイクロリットルのサンプルを移します。気泡が