ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

このビデオでは、受精後1〜3日のゼブラフィッシュ胚から、網膜および網膜色素上皮（RPE）が付着した網膜を微小 dissection（微小解剖）する方法を示します。すべての手順は、精密ピンセットと一般的な実験器具を用いて行うことができます。網膜解剖用の標準的な実体顕微鏡下で、単層のRPEを掃くような動作で除去し、培養プレートの表面へのRPEの付着を利用して剥離させます。

RPE付着網膜の剥離において、剥離前に胚を押し潰し洗浄することで、培養プレートの接着性を除去します。RPEを無傷に維持するため、この組織を慎重に持ち上げることで、脈絡膜と強膜をRPE付着網膜から効率的に分離し、続いて化学エッチングしたタングステン針を用いて水晶体を除去します。この解剖法により、無傷の網膜組織を得ることができ、ゼブラフィッシュの網膜および網膜色素上皮の組織特異的なRNA発現プロファイルの研究に有効に活用されています。

こんにちは。パデュー大学生物科学部のUFE Leon教授の研究室のLi Jangです。今日は、ゼブラフィッシュの胚眼組織の解剖方法について説明します。当研究室では、眼の発達を制御する遺伝子ネットワークを研究するためにこの手順を用いています。

それでは始めましょう。8. マイクロダイセクションの前に、以下の溶液を準備します。E3培地、フィルター滅菌したリンガー液、および5 N 水酸化ナトリウムです。

次に、タングステン針を化学的にエッチングします。水酸化ナトリウムの流出を防ぎ、ビーカーを扱いやすくするために、ペトリ皿の中に粘土を用いて小さなビーカーを固定します。ビーカーの側面に標準的なゼムクリップを取り付けます。

水酸化ナトリウム標準液を、クリップが水酸化ナトリウムに接触するまでビーカーに注ぎます。直流電源の負極をペーパークリップに、正極を短いタングステン線の片端に接続します。タングステン線のもう一方の端を直径4 mmの粘土球で包み、この端を水酸化ナトリウム溶液に浸します。

電圧を約3 Vまで上げ、水酸化ナトリウム溶液の中でワイヤーを1秒間隔で上下に浸す動作を約10分間繰り返します。水酸化ナトリウムにさらされたタングステンワイヤーは徐々に細くなり、陽極に接続されたワイヤーの反対側からクレイボールが脱落すると、鋭い針状になります。塩の堆積物を除去するために、鋭い針をリンガー液またはE3溶液で洗浄し、その後、胚の解剖に向けた扱いやすくするため、テープまたはニードルホルダーを用いて針を木製アプリケーターに取り付けます。

繁殖前夜に、標準的なプロトコルに従って成魚のスーパーフィッシュを飼育します。親魚を静止繁殖タンクに分け、ディバイダーを用いてペアごとに分離します。翌朝、室内灯が点灯した後にディバイダーを取り除き、30分ごとに10分間、親魚を交配させ、各交配の後に魚を分離します。

各交配で回収した胚を、E3 mediumを用いて28°Cで個別に維持します。受精後10〜12時間で胚のステージングを行い、特定の時間点での解剖直前に再度ステージングを行います。解剖にはFalcon 60 × 15 mmポリスチレン培養プレートを使用します。

未使用の新しいプレートは、約20分間にわたりRPE組織に対して固有の接着性を有しており、網膜剥離におけるRPEの除去に役立ちます。RPEが付着した状態の網膜が必要な場合は、解剖の30分前に、リンガー液を含む培養プレート内で2つの胚を完全に潰し、その後、解剖前に新鮮なリンガー液で十分に洗浄することで、この接着性を解消できます。すべての微細解剖は、1倍の対物レンズを装着したOlympus SC X 16顕微鏡を用い、約5～8倍の倍率で行います。

Dumontピンセットまたは化学エッチングされたタングステン針を使用し、顕微鏡ステージを28 °Cに加温します。温度変動の影響を最小限に抑えて網膜解離を開始するために、特定の発生段階にある胚を、RRPEなしの網膜解離の手順で準備したFalcon 60 × 15 mm培養プレート内の5 mLのリンガー液に移します。ピンセットの鋭い先端を用いて、頭部と前幹の一部を速やかに切り取り、ゼブラフィッシュの身体を除去します。次に、頭部・幹断片の後端を培養プレート上にピンで固定します。補助ピンセットを用いて、前額部から背側に向かって頭部を開きます。

脳を取り除き、眼の内側が露出し、以降の操作のために上を向くようにします。網膜を解剖するには、ピンセットの先端を使用して、上を向いた眼の内側の露出しているRPEを慎重に掃くようにして、網膜への小さな開口部が見えるまで操作します。網膜の内側がほとんどすべて露出するまで、掃く動作と剥離操作を続けます。

培養皿に向いた眼の網膜において、外側のRPEを除去する際、露出した網膜を傷つけたり突き刺したりしないように注意してください。培養プレートの表面から約45度の角度を保ち、ピンセットで眼をなでるように操作します。剥離したRPEの部分を培養プレートに固定して解剖し、鋸状帯に比較的強固に付着しているRPEを除去します。

次に、網膜をそっと持ち上げて残留したRPEを洗浄し、培養皿の接着性を利用して水晶体を回収します。この際、皿の表面にわずかに付着している網膜細胞を損傷させないよう注意してください。転がしても水晶体が離れない場合は、エッチング済みタングステン針を用いて水晶体表面を円状に刺激してください。

RPE付着網膜剥離を開始するために、RPE付着網膜剥離用に準備したFalcon 60×15 mm培養プレートを使用します。特定の発生段階にある胚を5 mLのリンガー液に移します。頭部と前肢の一部を切除します。

前述の手順に従い、速やかにゼブラフィッシュの体を取り出します。頭部から体幹にかけての部位の後端を培養プレート上にピンで固定します。補助鑷子を用いて、前頭部の前方から背側に向かって頭部を開きます。

眼の内側が露出し、上を向くように脳を取り除きます。ピンセットを用いてさらに操作を行う場合は、眼を後外側からそっと持ち上げ、前側へと転がします。RPE層の外側にある脈絡膜と強膜組織は皮膚に比較的強固に付着していますが、眼を慎重に前側に転がすことで、その大部分を剥離することができます。

眼の側面が露出し、網膜解剖のために眼がまだ皮膚に付着している状態で、タングステン針を用いて水晶体を除去します。RPEおよびRPEが付着した網膜を除いた後、解剖したサンプルを後続のRNA特性解析のためにTRIzolを入れたRNA用マイクロチューブに回収します。

RPEを伴わない網膜剥離に成功した例がここに示されており、網膜表面が損なわれていないことから網膜の完全性が維持されていることがわかります。対応する組織切片でも、網膜の構造が非常に良好に維持されていることが示されています。特に、光受容体層とRPEの間の細胞外マトリックスの保存状態が極めて良好です。

RPE付着網膜剥離が成功した場合は、RPE層が損傷なく連続して保持されています。対応する組織切片では、網膜細胞とRPE細胞の両方が良好な状態であることがわかります。剥離した網膜から抽出された全RNAは高品質です。

これは、バイオアナライザー分析から得られたエレクトロフェログラムおよびゲル画像によって示されます。ベースラインは平坦であり、18 sおよび28 sのリボソームピークは保持されています。RNA整合性番号（RIN）は通常9.8より大きくなります。

ゼブラフィッシュ胚性網膜を、網膜色素上皮（RPE）を含む場合と含まない場合の両方で採取するためのマイクロダイセクション手順について説明しました。この操作を行う際、網膜の剥離において最も重要なステップは、ピンセットの先端による掃引動作と組織のローリングであることに留意してください。RPEの残渣を除去する場合、剥離中に椅子の調節可能なアームレストに肘を置くことで、手の動きを大幅に安定させることができます。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。