Name: ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚眼の顕微解剖法。RPE付き・なしの網膜を分離し、組織特異的RNA発現解析に応用可能な技術です。発生生物学と神経科学の研究に有用です。

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この作品は、パーデュー大学で生物科学科からのスタートアップ資金によってサポートされています。

パート1：マイクロダイセクション前の準備<ol><li>ソリューション<ol class="lalpha"><li> E3培地4（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl 2および0.33 mMのMgSO 4を ）。 </li><li>リンゲル溶液1、5は （116 mMのNaCl、2.9 mMの塩化カリウム、1.8 mMのCaCl 2を 、5mMのHEPES、pH7.2）、フィルタは滅菌。 </li><li> 5N NaOHで。 </li></ol></li><li>タングステン針の化学エッチング<ol class="lalpha"><li>粘土でペトリ皿に5N NaOHを含む小さなビーカーを固定します。 </li><li>それは、NaOH溶液と接触するように、ビーカーの側面にペーパークリップを取り付けます。 </li><li>ペーパークリップやタングステン線の短い断片（〜2センチメートル）の一端に正極へのDC電源から負極を接続します。 </li><li>小さな粘土のボールを持つタングステン線のもう一方の端をラップし、NaOH溶液にこの端を浸し。 </li><li>約3Vまで電圧を増加し、良好なエッチング速度が得られるまでNaOH溶液で上下線を浸漬。良い品質の針は通常10分でエッチングすることができる。 </li><li>ソリューションにさらされるタングステン線は徐々に薄くなるでしょう。粘土のボールがオフに低下すると、まだ正極に接続されているワイヤの反対側には、鋭い針の形状を持つことになります。 </li><li>塩の付着物を除去するためにリンゲル液またはE3に鋭い針を洗浄します。 </li><li>テープや取り扱いを容易にするためニードルホルダーが木製のアプリケーターに針を取り付けます。 </li></ol></li><li>培養プレート<ol class="lalpha"><li>ファルコン60 × 15mmのポリスチレン培養プレートは、網膜のマイクロダイセクションのために使用する準備が整いました。 </li><li> RPE -添付の網膜を切開するため、30分解剖する前に表面の接着性を取り除くためにリンゲル液を含有する培養プレートで完全にtwo胚をつぶす。まもなく解剖する前に、新鮮なリンゲル液で広範囲にプレートを洗浄。 </li></ol></li><li>胚のコレクションとステージング<ol class="lalpha"><li>大人のゼブラフィッシュは、4、5を説明するように維持されます。 </li><li>分周器によって繁殖の前に夜をペアワイズ静的な繁殖タンク内の親魚を区切ります。 </li><li>部屋のライトが次の朝にオンになって後に分周器を取り外します。両親は10分間隔で30分おきに交差することができます。各交差点の後に魚を区切ります。 </li><li> 28で別々にE3培地に各交差点から収集された胚を維持℃に</li><li>確立された基準（1）（6）によれば、特定の時点で10〜12時間後に受精（HPF）でと再演するすぐに解剖する前段階の胚、。 </li></ol></li></ol>パート2：解剖-脳の除去と眼のばく露1 <ul><li>このセクションで説明する手順は、網膜（パート3A）及びRPE -添付の網膜を（パート3B）解剖のための共通です。 </li><li>すべての微細な解剖はデュモン鉗子の先端でおこなわれており、組織を位置決めするためのデュモン鉗子の別のペアによって援助されています。必要に応じて化学的にエッチングされたタングステンの針は、細かい操作に使用することができます。 </li><li>すべての微細な解剖は1X目的または同等の装備オリンパスSZX16顕微鏡下で〜5倍速の倍率で実行されます。 </li><li> 28でベンチトップインキュベータにE3培地で胚を維持℃の解剖時に簡単に胚のアクセスのための顕微鏡の隣にある。 </li><li>顕微鏡のステージは、遺伝子発現に及ぼす温度変動の影響を最小限に抑えるためにサーモプレートで28℃に加温している。 </li></ul><ol><li>第1部＃3で説明したように調製されたファルコン60 × 15mmの培養プレートでリンゲル液に特定の発達段階にある胚を移す。 </li><li>体内から速やかに前方トランクの部分で頭を切り落とします。 </li><li>支援鉗子で培養プレートにこの組織の後端を固定。 </li><li>前額から始まる背側に頭を開きます。 </li><li>目の内側が露出され、さらなる操作のために上向きになるように脳を取り外します。 </li></ol>パート3a：網膜切開1 <ol><li>として第2部で説明されている胚を準備する。 </li><li>網膜に小さな開口部が見られるまで慎重に鉗子の先端が上向きに直面している眼球の内側に露出したRPEを磨きます。 </li><li>ブラッシングと網膜の内側はほぼすべてが露出するまでアクションを剥離を継続する。露出網膜を傷つけないし、パンチは避けてください。 </li><li>今下向き直面している網膜、アプローチに横方向のRPEを削除することと培養プレートの表面から約45 °の角度でブラシ。 </li><li> cにRPEのデタッチ部分を固定することによって、鋸状縁に比較的しっかりと接続されてRPEを削除します。ulture郭清のためのプレート、そして次にゆっくりと網膜を持ち上げます。 </li><li>残留RPEをクリーンアップするために培養皿の底に網膜をロールバックします。 <ol class="lalpha"><li>我々は、胚が粉砕されると、この特定のファルコンのポリスチレン培養プレートは、約20分間RPEの優先的な密着性を持っていることに気づいた。このプロパティは、RPEの残党の除去のために利用されている。しかし、網膜細胞は、高倍率下で密接に検査することができるより少ない程度に表面に棒を行います。一つは、RPEの除去と網膜の整合性の完全性とのバランスを持っています。 </li><li>レンズは、しばしば培養プレートに付着し、圧延工程中に網膜から切り離します。時折、それはレンズの表面に渦巻くアクションでエッチングされたタングステン針でレンズを取り外すときに必要です。 </li></ol></li><li>これらの手順は、正常組織の整合性を損なうことなく、網膜からRPEを削除することができます。これは、良好な全体的な形態（図1B及びB'）と組織学（図1B"）で示される、矢印特に、光受容体層とRPEとの間の細胞外マトリックスの保全が（図1B非常に良いです。";全胚（図1A"））から、組織型で比較する。 </li></ol>一部3B：RPE接続網膜解剖3 <ol><li>として第2部で説明されている胚を準備する。 </li><li>助手の鉗子によって培養プレートに頭部を固定。後部側面からそっと目を持ち上げて、前方側にロールバックします。 <ol class="lalpha"><li> RPE層の外側に推定脈絡膜と強膜組織は、皮膚に、比較的しっかりと接続されており、主に前方側に注意深く目を圧延して剥離することができる。 </li></ol></li><li>目の側面が露出していると眼がまだ肌に接続されているときに後のタングステン針でレンズを外します。 </li><li>これらのプロシージャは、正常網膜で全体RPE層を保持することができます。推定脈絡膜と強膜組織は、主に（図1C、C'とC"）は削除することができます。 </li></ol>パート4：RNAの作業のための組織サンプルの収集<ol><li>解剖のサンプルは1日より前に説明したように下流のRNAの特性評価のためのRNaseフリーのマイクロチューブにTRIZOLに集めることができます。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1（）解剖前の52 HPFにおけるゼブラフィッシュ幼生の頭部の横方向と（'）背ビュー。幼虫の頭の中で（）＆（'）の（"）に対応する組織切片（B）側面と（B'）54 HPFにおける解剖網膜の背ビュー。網膜の表面には、両方の側面から無傷だったと背側ビュー。（B）＆（B'）の解剖網膜の（B"）に対応する組織切片。網膜と網膜積層構造は無傷であった。特に、光受容体層とRPE（間細胞外マトリックスは、"（、矢印、矢印）も解剖網膜B）に保存されていました"。 （C）側方および52 HPFにおける解剖RPEに接続された網膜の（C'）内側のビュー。 RPE層はまた、切除した組織の組織切片（C"）で示された、無傷と連続だった。C'の白い領域は、視神経（矢印）である。組織は、組織試料を4％で収集し、修正された3を説明するようにパラホルムアルデヒド。埋め込 ​​み、これらの試料のセクショニングのプラスチックを行った。スケールバー=50μmのは。

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

動物実験は、パーデュー大学の動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

ゼブラフィッシュの眼の組織の顕微解剖は、効果的に無傷の網膜とRPEに接続された網膜を取得することができます。これは実質的に特定の眼組織（すなわち、網膜や網膜色素上皮）に関連する発現研究を支援します。実際に、我々が正常に全体の網膜1とRPE 3のRNAの発現プロファイルを取得するには、次の手順を利用してきた。これらのプロファイルのユーティリティが強く網膜分化変異体2に摂動される経路と遺伝子ファミリーの我々の最近の識別によってサポートされています。網膜解剖の手続きにおいて最も重要なステップは、鉗子とRPE残骸の除去のための圧延組織の先端でブラッシングアクションです。我々は、解剖時に椅子に調節可能なアームレストに肘を置くことは、実質的に不要な手の動きを安定させることができる見つける。また、いくつかのRPEの残党は、鋸状縁に残ることがあります。この地域は、解剖のための培養プレートの接着面に接触できないためです。それにもかかわらず、ほとんどのRPE細胞は、ブラッシングと剥離作用の間に破壊し、これらのRPE残骸はそのままになることはほとんどありませんしている。また、バランスが網膜の整...

<table><tbody><tr><td>コードレスペッスルモーター</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>直流電源</td><td>ラスカー</td><td>PSU130</td><td>どのような直流電源でも使用可能です。別の装置を使用する場合は、その電圧についてさらに最適化を行う必要があります。</td></tr><tr><td>使い捨てペッスル &amp;マイクロチューブ、1.5 mL（DNase、RNase、パイロジェンフリー）</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>これらは、発現解析のためにTRIzolを用いて組織を回収する際に使用されます。</td></tr><tr><td>Dumont #5ピンセット、先端：0.05 x 0.01mm、イノックス（ステンレス製）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>先端の寸法は、細いことが望ましいが、固定的なものである必要はない。というのも、必要に応じて随時、先端を研磨する必要があるためである。</td></tr><tr><td>Dumont #5SFピンセット、先端：0.025 x 0.005mm、ステンレス製</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>微細なチップ径が望ましいが、随時チップを研磨する必要があるため、厳格に固定されている必要はない。</td></tr><tr><td>Falconポリスチレン培養プレート、60 X 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>これらのプレートは解剖プレートとして使用します。</td></tr><tr><td>オリンパス SZX16 実体顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>SZX16</td><td>実体顕微鏡であればどのようなものでも使用可能です。先行研究ではLeica社製の実体顕微鏡を使用しました。&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; 問題なく行えました。また、2倍の対物レンズを装着していましたが、解剖には1倍の対物レンズのみを使用しました。 </td></tr><tr><td>砥石</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>必要に応じて、これを用いてピンセットの先端を研いでください。</td></tr><tr><td>サーモプレート</td><td>東海ヒット</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>これは、解剖中の組織の温度を維持し、温度変動が遺伝子発現に及ぼす影響を最小限に抑えるために使用されます。また、顕微鏡全体を28℃に制御された環境室内に設置しています。&amp;#x00B0;先行研究における解剖中のC&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; 良好な結果を得た。</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>タングステン線、直径0.015インチ</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>木製アプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>807</td><td>これは、化学エッチング処理したタングステン針を保持するために使用します。</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

ゼブラフィッシュは、その急速の眼の発生に関する研究のための人気の動物モデルである<em&gt; EX子宮</em&gt;開発と良い産卵。 3日後の受精（DPF）によって、幼虫は、最初の視覚的な応答が表示されます。多くの遺伝子は、適切な眼の発生を制御するために同定されたが、我々は、基礎となる遺伝的構造の完全な理解にはほど遠いですされています。全ゲノムの遺伝子発現プロファイリングは、眼の開発のための遺伝子調節ネットワークを解明するために有用なツールです。しかし、ゼブラフィッシュの胚の眼の小さいサイズは、それが挑戦的な発現解析のための完全な、純粋な眼の組織を得ることができる。レンズの径が100μm以下であるたとえば、2日目と3の間に目の前後の長さは、唯一の約200から300μmである。また、網膜の根底にある網膜色素上皮（RPE）はちょうど単層上皮である。遺伝子発現プロファイルは全胚から得られる一方で、彼らは正確にこれらの組織の表現を表すものではありません。したがって、純粋な組織は、眼の開発の成功した遺伝子発現プロファイリングのために取得する必要があります。この問題に対処するために、我々は、眼の形態形成の主要な段階をカバーする1から3 DPF、から添付RPEで無傷の網膜と網膜を顕微解剖する手法を開発しました。すべての手順は、標準的な実体顕微鏡下で微細な鉗子と一般的な実験室の電源で行うことができます。網膜の解剖のために、単層RPEは、アクションと解剖のための培養プレートの表面にRPEの残党の優先的な遵守をブラッシングして除去し、剥離​​する。 RPEが完全に網膜で保存できるように、RPEに接続された網膜節郭清については、解剖のプレートにRPEの遵守は、解剖前に削除されます。この組織を慎重に持ち上げアクションは、効率的に推定脈絡膜と強膜を分離することができます。レンズは、化学的にエッチングされたタングステンの針が両方のケースで削除することができます。要するに、我々のアプローチは、そのまま眼の組織を得ることができますし、正常にゼブラフィッシュの網膜の組織特異的発現プロファイルを研究するために利用されている<sup&gt; 1、2</sup&gt;と網膜色素上皮<sup&gt; 3</sup&gt;。

この記事では、1〜3日postfertilizationの胚から、接続されている網膜色素上皮がある場合とない場合のゼブラフィッシュ網膜を顕微解剖するアプローチを説明します。

ゼブラフィッシュは、体外での発生が早く、産卵数が多いことから、眼の発達に関する研究において一般的な動物モデルとなっています。受精後3日までに...

このビデオでは、受精後1〜3日のゼブラフィッシュ胚から、網膜および網膜色素上皮（RPE）が付着した網膜を微小 dissection（微小解剖）する方法を示します。すべての手順は、精密ピンセットと一般的な実験器具を用いて行うことができます。網膜解剖用の標準的な実体顕微鏡下で、単層のRPEを掃くような動作で除去し、培養プレートの表面へのRPEの付着を利用して剥離させます。RPE付着網膜の剥離において、剥離前に胚を押し潰し洗浄することで、培養プレートの接着性を除去します。RPEを無傷に維持するため、この組織を慎重に持ち上げることで、脈絡膜と強膜をRPE付着網膜から効率的に分離し、続いて化学エッチングしたタングステン針を用いて水晶体を除去します。この解剖法により、無傷の網膜組織を得ることができ、ゼブラフィッシュの網膜および網膜色素上皮の組織特異的なRNA発現プロファイルの研究に有効に活用されています。こんにちは。パデュー大学生物科学部のUFE Leon教授の研究室のLi Jangです。今日は、ゼブラフィッシュの胚眼組織の解剖方法について説明します。当研究室では、眼の発達を制御する遺伝子ネットワークを研究するためにこの手順を用いています。それでは始めましょう。8. マイクロダイセクションの前に、以下の溶液を準備します。E3培地、フィルター滅菌したリンガー液、および5 N 水酸化ナトリウムです。次に、タングステン針を化学的にエッチングします。水酸化ナトリウムの流出を防ぎ、ビーカーを扱いやすくするために、ペトリ皿の中に粘土を用いて小さなビーカーを固定します。ビーカーの側面に標準的なゼムクリップを取り付けます。水酸化ナトリウム標準液を、クリップが水酸化ナトリウムに接触するまでビーカーに注ぎます。直流電源の負極をペーパークリップに、正極を短いタングステン線の片端に接続します。タングステン線のもう一方の端を直径4 mmの粘土球で包み、この端を水酸化ナトリウム溶液に浸します。電圧を約3 Vまで上げ、水酸化ナトリウム溶液の中でワイヤーを1秒間隔で上下に浸す動作を約10分間繰り返します。水酸化ナトリウムにさらされたタングステンワイヤーは徐々に細くなり、陽極に接続されたワイヤーの反対側からクレイボールが脱落すると、鋭い針状になります。塩の堆積物を除去するために、鋭い針をリンガー液またはE3溶液で洗浄し、その後、胚の解剖に向けた扱いやすくするため、テープまたはニードルホルダーを用いて針を木製アプリケーターに取り付けます。繁殖前夜に、標準的なプロトコルに従って成魚のスーパーフィッシュを飼育します。親魚を静止繁殖タンクに分け、ディバイダーを用いてペアごとに分離します。翌朝、室内灯が点灯した後にディバイダーを取り除き、30分ごとに10分間、親魚を交配させ、各交配の後に魚を分離します。各交配で回

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

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JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、我々は共焦点顕微鏡による単一細胞の解像度でのライブゼブラフィッシュの胚で開発脊椎動物の脳を分析するためにする方法を示しています。これは、我々は、単一セルのゼブラフィッシュの胚を注入し、その後、脳の発達をマウントし、イメージする方法が含まれています。...

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

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ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

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学ぶゼブラフィッシュ胚眼の顕微解剖法。RPE付き・なしの網膜を分離し、組織特異的RNA発現解析に応用可能な技術です。発生生物学と神経科学の研究に有用です。

ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖

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