膵臓腫瘍におけるex vivo T細胞刺激:T細胞におけるサイトカイン産生を増加させる方法

- 活性化されたT細胞は膵臓腫瘍微小環境に移動し、そこでインターフェロンガンマ(IFNガンマ)や腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)などのサイトカインを放出し、効果的な抗腫瘍反応を媒介するのに役立ちます。サイトカインがT細胞から急速に移動するため、細胞内レベルは検出できなくなる可能性があります。したがって、T細胞は、腫瘍におけるそれらの治療的役割を研究するために、基礎サイトカイン産生を増加させるための刺激を必要とします。

まず、マウスの膵臓から腫瘍細胞の懸濁液を採取します。次に、細胞懸濁液中に存在するT細胞をサイトカイン刺激カクテルで処理し、混合物を所望の時間インキュベートします。このカクテルは、小胞体から細胞質へのカルシウムイオンの放出を促進します。カルシウム濃度が高いと、特定の核転写因子が活性化され、T細胞のサイトカイン産生が増加します。

次に、タンパク質輸送阻害剤カクテルで細胞を処理し、チューブをインキュベートします。このカクテルは、小胞体からゴルジ複合体へのサイトカイン輸送をブロックし、細胞内にサイトカインを蓄積させます。最後に、フローサイトメトリー解析に適した細胞内マーカーを使用して細胞を染色します。以下のプロトコールでは、T細胞刺激を行い、サイトカインの細胞内濃度を高めます。

- まず、鉗子を使用して腫瘍をペトリ皿に移します。酵素活性が始まるのを防ぐために、氷上の50ミリリットルのチューブに5ミリリットルの消化培地を保管してください。この溶液の少量のアリコートを取り、ペトリ皿の腫瘍を覆います。滅菌メスと鉗子を使用して、腫瘍を長さが約3ミリメートル未満の小片に切ります。腫瘍片をチューブにこすり落とし、すべての部分が消化媒体に沈むまでチューブを静かに反転させます。チューブを振とう装置に37°Cで20分間移し、消化します。腫瘍のすべての部分が水没し、チューブの端にくっつかないことを確認してください。

消化ステップの直後に、チューブを氷の上に置いて酵素の活性を遅らせます。EDTAを添加して最終濃度を20ミリモルにし、サンプルを短時間ボルテックスして混合すると、酵素活性がさらに遅くなります。チューブを開き、チューブの蓋から腫瘍消化物を新鮮なRPMI培地で洗い流します。次に、70ミクロンのストレーナーを準備します。氷の上の50ミリリットルのオープンチューブに置きます。フィルターをメディウムで事前に濡らします。消化した細胞を再懸濁し、25ミリリットル以上のストリケットを使用してチューブの側面を洗浄します。ストリペットの開口部が広いため、濃厚なダイジェストを簡単に通過させることができます。

25ミリリットルのストリケットを使用して、すべての消化物をストレーナーに移します。1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、フィルターの上部で腫瘍を上下にマッシュしま