JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 5:00 分 • April 30th, 2023
- 活性化されたT細胞は膵臓腫瘍微小環境に移動し、そこでインターフェロンガンマ(IFNガンマ)や腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)などのサイトカインを放出し、効果的な抗腫瘍反応を媒介するのに役立ちます。サイトカインがT細胞から急速に移動するため、細胞内レベルは検出できなくなる可能性があります。したがって、T細胞は、腫瘍におけるそれらの治療的役割を研究するために、基礎サイトカイン産生を増加させるための刺激を必要とします。
まず、マウスの膵臓から腫瘍細胞の懸濁液を採取します。次に、細胞懸濁液中に存在するT細胞をサイトカイン刺激カクテルで処理し、混合物を所望の時間インキュベートします。このカクテルは、小胞体から細胞質へのカルシウムイオンの放出を促進します。カルシウム濃度が高いと、特定の核転写因子が活性化され、T細胞のサイトカイン産生が増加します。
次に、タンパク質輸送阻害剤カクテルで細胞を処理し、チューブをインキュベートします。このカクテルは、小胞体からゴルジ複合体へのサイトカイン輸送をブロックし、細胞内にサイトカインを蓄積させます。最後に、フローサイトメトリー解析に適した細胞内マーカーを使用して細胞を染色します。以下のプロトコールでは、T細胞刺激を行い、サイトカインの細胞内濃度を高めます。
- まず、鉗子を使用して腫瘍をペトリ皿に移します。酵素活性が始まるのを防ぐために、氷上の50ミリリットルのチューブに5ミリリットルの消化培地を保管してください。この溶液の少量のアリコートを取り、ペトリ皿の腫瘍を覆います。滅菌メスと鉗子を使用して、腫瘍を長さが約3ミリメートル未満の小片に切ります。腫瘍片をチューブにこすり落とし、すべての部分が消化媒体に沈むまでチューブを静かに反転させます。チューブを振とう装置に37°Cで20分間移し、消化します。腫瘍のすべての部分が水没し、チューブの端にくっつかないことを確認してください。
消化ステップの直後に、チューブを氷の上に置いて酵素の活性を遅らせます。EDTAを添加して最終濃度を20ミリモルにし、サンプルを短時間ボルテックスして混合すると、酵素活性がさらに遅くなります。チューブを開き、チューブの蓋から腫瘍消化物を新鮮なRPMI培地で洗い流します。次に、70ミクロンのストレーナーを準備します。氷の上の50ミリリットルのオープンチューブに置きます。フィルターをメディウムで事前に濡らします。消化した細胞を再懸濁し、25ミリリットル以上のストリケットを使用してチューブの側面を洗浄します。ストリペットの開口部が広いため、濃厚なダイジェストを簡単に通過させることができます。
25ミリリットルのストリケットを使用して、すべての消化物をストレーナーに移します。1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、フィルターの上部で腫瘍を上下にマッシュします。RPMIを使用して、ストレーナーを通して細胞を連続的に洗浄します。細胞を押し通すのに十分な力で洗うようにしてください。すべての細胞がストレーナーを通過するまで洗浄を続けます。チューブを300倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。
細胞ペレットを慎重に再懸濁してRPMIを完了し、別のフィルターを直接通過させて、適切に再懸濁できない細胞外マトリックスや大きな細胞塊を取り除きます。刺激が不要な場合は、単離した細胞をすぐに染色してフローサイトメトリー解析を行うか、FBS中の10% DMSOの凍結培地に再懸濁し、マイナス80°Cで保存してください。
刺激を行うには、まず細胞を数えます。細胞を完全な培地で希釈して、100マイクロリットルあたり10の2倍から6の濃度を達成します。U底の96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞をプレートします。PMAとイオノマイシンの2倍調製物を含む100マイクロリットルの完全培地を追加します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに5%の二酸化炭素を入れて1時間置きます。次に、Brefeldin-AとMonensinの10倍調製物と完全な培地を20マイクロリットル加えて、それぞれ1.06マイクロモルと2.0マイクロモルの最終濃度を達成します。プレートをインキュベーターにさらに4時間戻します。