3Dスフェロイドにおける細胞外フラックスアッセイ:膵臓腫瘍スフェロイドの代謝活性を測定する方法

- 膵臓がん細胞は、腫瘍微小環境またはTMEでがん関連線維芽細胞と相互作用します。これらの相互作用は、がん細胞の代謝活性を調節し、がんの進行に影響を与えます。

スフェロイドは、in vitroでTMEを再現する細胞凝集体です。したがって、これらのスフェロイドを使用して、細胞外フラックスアッセイによって腫瘍の代謝機能の変化を試験することができます。このアッセイでは、酸素と陽子の細胞外濃度を測定し、それぞれ好気性代謝と解糖代謝を決定します。

まず、膵臓がん細胞と膵臓線維芽細胞を共培養して作製した適切なサイズの3Dスフェロイドを採取します。次に、スフェロイドをフラックス分析プレートに移し、被験薬の入ったセンサーカートリッジで覆います。細胞外フラックス分析装置でアッセイを実行します。

フラックスアナライザーは、特定の時点でセンサーカートリッジから分析プレートに試験薬を空気圧で注入します。被験薬に応答して、細胞はプロトンと酸素をプレートマイクロチャンバーに放出し、センサープローブに存在する蛍光色素がこれらのレベルを測定します。最後に、適切なソフトウェアを使用して、スフェロイドの機能を解析します。

次のプロトコルでは、細胞外フラックスアッセイを使用して、3Dスフェロイドに存在する膵臓腫瘍細胞の代謝機能を測定する方法を示します。

メタボリックアッセイの前日に、付属のユーティリティプレートでウェルあたり200マイクロリットルのアッセイキャリブレーションでプローブカートリッジを水和し、加湿した摂氏37度の非CO2インキュベーターでユーティリティプレートを一晩インキュベートします。

翌朝、成長プレート内のスフェロイドを光学顕微鏡で観察し、その形態と全体的な均一性を確認します。成長プレートを磁気保持ドライブに移し、ウェルあたり約120マイクロリットルの成長培地を慎重に吸引します。

スフェロイドを120マイクロリットルの温めたアッセイ培地で3回優しく洗浄します。最後の洗浄後、スフェロイドが洗い流されていないことを確認するために、顕微鏡でスフェロイドを再度検査し、各ウェルに180マイクロリットルの温かいアッセイ培地を追加します。

幅の広い穴の開いた先端を使用して、細胞忌避剤増殖プレートから1つの洗浄済みスフェロイドを慎重に吸引し、スフェロイドアッセイプレートの1つのウェルの中央に直接スフェロイドを静かに移し、スフェロイドが重力によってウェルの中央マイクロチャンバーに落下できるようにします。

すべてのスフェロイドを移し終えたら、アッセイプレートをCO2を含まない摂氏37度の加湿空気インキュベーターに1時間置きます。インキュベーション中は、A列からH列が左側に来るようにセンサーカートリッジを向け、ロードするポートに対応する文字が左上隅に来るようにカートリッジの上部にローディングガイドを配置します。

プレートが均等にロードされている場合は、解析ソフトウェアを開き、[テンプレート]をクリックします。[Blank Template] をダブルクリックし、[Generate Groups] をクリックします。「Plate Map」タブで、実験デザインに対応するアッセイプレートにグループを割り当て、バックグラウンドウェルとして 4 つのコーナーウェルを選択します。

「Instrument Protocol」タブで、「Calibrate」、「Equilibrate」、および「baseline Measurements Cycle」をオンにします。[Injections]をクリックし、各ポートのコンパウンドを定義します。測定サイクルを6に変更します。プロトコールとグループの概要を確認し、アッセイデザインテンプレートを保存します。

アッセイ設計をガイドとして、マルチチャンネルピペットを使用して各試薬を直接注入ポートに分注し、ローディングガイドを指先で所定の位置に保持します。すべての試薬がロードされたら、ローディングガイドを取り外し、カートリッジを目の高さに保持して、注入ポートが均一にロードされているかどうかを目視検査します。

カートリッジとユーティリティプレートを細胞外フラックス分析装置に移し、アッセイ前のキャリブレーションを開始します。キャリブレーションが完了したら、ユーティリティプレートを3Dスフェロイドを含む予熱したアッセイプレートと交換し、アッセイを開始します。アッセイが終了したら、データを適切なデータ解析ソフトウェアにエクスポートします。