スフィア形成アッセイ:膵臓がん幹細胞およびスクリーニング療法を同定するためのIn vitro法

- 膵管腺がん(PDAC)には、腫瘍原性がん幹細胞(CSC)のみのサブセットが含まれています。CSCは自己再生可能で、多能性であり、腫瘍を形成することができます。それらは抗アポトーシスタンパク質を発現し、また多剤耐性遺伝子も含んでいるため、化学療法に耐性があります。がん幹細胞を同定し、それらに対する薬剤の影響を調べるために、球体形成アッセイを行います。

まず、抽出したがん幹細胞を目的の細胞培養液に懸濁します。次に、細胞懸濁液をマルチウェルプレートに播種し、所望の期間インキュベートします。必要な量の目的の薬物をいくつかのウェルに加え、他のウェルにプラセボをネガティブコントロールとして追加します。細胞を所望の期間インキュベートします。がん幹細胞は、非接着性の培養環境下で球状のコロニーを形成します。

インキュベーション後、少量の細胞懸濁液を血球計算盤にピペットで移し、自動セルカウンターに入れます。次に、形成された球の数を数えます。薬物処理された細胞は、通常、球体のサイズと数が大幅に減少します。次のプロトコルでは、膵臓がん幹細胞を同定し、メトホルミンの効果を評価するために球体形成アッセイを行います。

- がん幹細胞濃縮のための腫瘍球形成を促進するために、がん幹細胞培地の適切な容量で細胞を1ミリリットルあたり3細胞の2倍10の最終濃度に希釈し、氷上で数分間冷却します。次に、24超低接着細胞プレートの最初と最後の列に500マイクロリットルのPBSを添加した後、ピペットで細胞を再懸濁し、プレートの空のウェルにウェルあたり1ミリリットルの細胞を播種します。

細胞の4つのウェルを目的の薬物で処理し、少なくとも4つのネガティブコントロールウェルをビヒクルで処理します。次に、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と1週間インキュベートします。一日おきに、各井戸に新鮮な処理または車両を追加します。

5日目または7日目に、より大きな構造の同定を可能にする自動セルカウンターで形成された腫瘍球の数を評価します。腫瘍球の連続継代のために、7日目に、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを使用して球体を採取します。次に、球体をスピンダウンし、1ミリリットルのトリプシンで摂氏37度で20分間インキュベートし、ペレットを単一細胞懸濁液に解離します。次に、先ほど示したように、細胞をさらに7日間拡大します。