DNA損傷病巣の評価:免疫蛍光染色を用いたがん細胞株における放射線誘発性DNA損傷病巣の同定

- 電離放射線は、一本鎖切断またはSSBおよび二本鎖切断またはDSBなど、さまざまな種類のDNA損傷を誘発します。一本鎖切断またはSSBは、放射線が塩基を損傷してDNA骨格を切断するときに発生しますが、二本鎖切断(DSB)は、2つのSSBが反対側のDNA鎖で発生するときに発生します。DSB形成の最初のステップは、H2AXヒストンのリン酸化であり、これは免疫蛍光染色によって視覚化できます。

免疫蛍光染色を行うには、シャーレに入れたカバースリップに固定したサンプルに一次抗体を添加します。抗体はリン酸化ヒストンタンパク質γ-H2AXに結合します。サンプルをインキュベートし、PBSで洗浄して、結合していない抗体を除去します。次に、一次抗体を認識して結合する蛍光色素を持つ二次抗体を添加します。必要な量のDAPI蛍光染色液を添加して、核に対比染色します。

封入剤を入れたスライドガラスにカバースリップをやさしく取り付け、蛍光顕微鏡で細胞を観察します。γ-H2AX病巣は、照射されたがん細胞に明確な蛍光ドットとして現れます。以下のプロトコールでは、放射線照射を受けたヒト結腸がん細胞株の免疫蛍光染色を行い、放射線誘発性DNA修復病巣を同定します。

- 照射後、付着した細胞から培地を取り出し、2.5ミリリットルのPBSで一度洗浄してください。次に、細胞を1ミリリットルの70%エタノールで10分間固定します。細胞を透過化するために、エタノールを除去し、2.5ミリリットルのPBSで洗浄します。0.2% Triton X-100をPBS中に1ミリリットルを静かに加えてカバースリップを覆い、細胞を室温で5分間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、PBSで希釈した1ミリリットルの2%BSAで透過化をブロックします。次に、細胞を2% BSAで最低30分間インキュベートします。細胞を染色するには、テキスト原稿で推奨されているように、PBSでBSAで希釈した一次抗体を適量追加します。次に、ペトリ皿に蓋をして、湿度を保つために保湿リグニンを入れたプラスチックの箱に入れます。摂氏37度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、PBSで3回の洗浄を行い、適切な量の二次抗体を添加します。保湿リグニンを入れたプラスチックの箱に皿を戻し、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。次に、PBSで洗浄を繰り返し、最終濃度1ミリリットルあたり1マイクログラムに希釈したDAPI100マイクロリットルを加えて、核を対比染色します。

細胞を室温で最大2分間インキュベートし、PBSで洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、PBSを取り外し、気泡の形成を避けるために、封入剤の上にカバースリップを静かに置きます。カバースリップの端をマニキュアで密封し、封入剤を硬化させてから蛍光顕微鏡検査を行います