Name: げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 学ぶ 野生げっ歯類の皮膚・肺組織からコラゲナーゼ消化を用いてプライマリ線維芽細胞を効率的に分離・培養する方法。この技術は比較細胞生物学研究において有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

我々は、このプロトコルの最初のバージョンをご提供するためスティーブンAustadに感謝。この作品は、NIHとエリソン医学財団からVGへの補助金によってと同様にサポートされて

1。始める前に<ol><li> 70％エタノールではさみや鉗子を滅菌する。 </li><li> 30mLのビーカー、箔の2層にカバーし、オートクレーブ内部の小さなマグネチックスターラーを置きます。 </li><li>滅菌水で28ワンチユニット/リベラーゼBlendzyme 3 mLの原液を準備します。 -20℃で0.5 mLを分注して凍結を行うあらゆる使用の前に新しいアリコートを解凍。解決策は融解後、混濁している場合があります。渦解が明確になるまで。 </li><li>細胞培養培地をウォームアップ。 </li></ol> 2。動物サンプルの調製 注意 ：野生動物が狂犬病ウイルスなどの病原体が含まれることがあります。常にオープン鋭利に注意してください。 <ol><li>動物を安楽死させると4で死体を置く℃に動物はフィールドで収集されているかのようにこのような実用的でない場合、それは、しかし、すぐに死体を使うのが最善である、死体は24時間以内に使用することができます。 24時間後の細胞収率が低下する。 </li><li> （ではない組織培養フードの）手術室で、または化学フードで動物を解剖。 </li><li>脇の下エリアでは、脇の下の皮膚が薄くなるように、脂肪分が含まれている皮膚のサンプルを収集するのに便利なサイトです、そして毛皮は密度が低いです。 70％エタノールで切開部位を清掃してください。毛皮は、エタノールに浸したされていることを確認します。 </li><li>鋭いメスで切開部位の周りに毛皮を剃る。希望の切開部位よりも大きい領域にひげをそる。皮膚へのカットを最小限に抑えるようにしてください。 70％エタノールで面積をスプレーし、乾燥させます。 </li><li>皮膚サンプルの消費税の約1 cm 2の断片を収集する。組織鉗子で皮膚をつまんで、はさみで切る。脂肪は、コラゲナーゼ消化を妨げるとして、皮膚と脂肪層を切らないようにしてみてください。肺のサンプルを収集するには、70％エタノールで胸の部分を洗浄し、T字型の切開を行うと皮膚のフラップを離れて引っ張って、ハサミで胸の皮膚を開きます。 70％エタノールで開かれた筋肉のエリアを洗い、乾燥させる。滅菌ピンセットやハサミを使用して胸郭をカット（大型動物のために骨のカッターを使用）。内臓の汚染を避けるために、無菌技術を使用してください。動物の毛皮を触る楽器で内臓を触れないでください。滅菌ピンセットやハサミを使って約1 cm 2の肺の断片をカット。 </li><li>乾燥を避けるために滅菌PBSで50 mLチューブに場所の組織片。 </li><li>エタノールによる組織片を50 mLチューブの外側を洗浄し、組織培養フードにそれらを取る。 </li><li>適切に動物の死体を処分。 </li></ol> 3。抽出セル<ol><li>滅菌メスを用いて10 cmの組織培養皿に組織片を転送する。サンプルであまりにも多くのPBSを転送しないでください。 </li><li> twoメスを用いて〜1mmの部分にティッシュを切る。シザー作用中心から開始して離れて引っ張っを使用して2つのブレードを使用してください。組織は、ピース単位でカットしていない、まで丸めたしてください。皮膚のパテに似てカットが十分であるときに、それは部分に分離することはありませんが薄いストレッチされます。肺組織では、カットする方が簡単です、そしてそれは、小さな断片に分割します。 </li><li>メスを使用して、滅菌攪拌棒で滅菌30mLのビーカーにカット組織を移す。 / 0.14ワンチ単位mLのリベラーゼBlendzyme 3、および1X抗生物質/抗真菌剤でDMEM/F12メディアの10mLで組織の切断に使用されるプレートを洗浄し、組織片を30 mLのビーカーにソリューションを追加。 </li><li>無菌箔でビーカーをカバーし、30〜90分間、ゆっくり攪拌し、37℃でインキュベートする。インキュベーションの長さは、種や組織型によって異なります。組織を過剰に消化しないように注意してください。組織片は、消化の終わりにまだ存在しているときに最高の収率が得られる。皮膚は肺よりも消化に時間がかかります。大型動物からの皮膚は、消化に時間がかかります。 30分後に消化し、10分ごとに確認してください。皮膚の消化が完了すると、メディアは曇りと互いに別々の皮膚の断片になり、作品の端は"ファジー"になる。肺の断片が赤から白への色を変更し、粘着性繊維を形成する起動時に肺消化を停止する必要があります。 </li><li>ピペットで塊を破壊するために上下組織断片を含む溶液を。滅菌50 mlチューブにソリューションを転送する。フラグメントは、10 mLのピペットの先端と消化によって容易に移動する場合はよく行われていた。 15％FBS、抗生物質/抗真菌剤1Xと暖かいDMEM/F12メディアの10mLでビーカーを3回リンスし、組織片を50 mLの試験管にメディアを追加します。 50 mLのチューブと反転数回転倒混和を閉じます。メディアのFBSは、リベラーゼ消化を停止します。 </li><li> 5分間、スイングバケット組織培養の遠心機で524グラムで回転する。上清を取り除く。 15％FBS、1X抗生物質/抗真菌剤で暖かいDMEM/F12メディア10mLにペレットを再懸濁する。ピペットでサスペンション付き組織片を破壊する力の最大値を設定します。 </li><li> 15％FBS、1X 5分間スイングバケット組織培養の遠心機で524グラムで、抗生物質/抗真菌剤、混合および遠心機でDMEM/F12メディアの別の30 mLを加え。リベラーゼの痕跡を削除する1つより多くの時間を繰り返します。 </li><li> 37 1X抗生物質/抗真菌剤および組織培養インキュベーターで10 cmの組織培養皿と場所への転送、15％FBSとDMEM/F12メディア10mLにペレットを再懸濁します° C、5％CO 2、3％O 2 。 </li><li>板の線維芽細胞とメディアの色のための毎日をチェックしてください。分離が成功した場合、線維芽細胞は組織片からはい出るとプレート（図1）に取り付けます。線維芽細胞は2-5日以内に組織片を終了し始めます。 </li><li>黄色へのメディアの色が変化した場合、これは潜在的な汚染またはセルの過密を示します。高倍率での顕微鏡でプレートを調べます。細菌、真菌、またはワームは、現在のプレート（これはほとんどの実験動物との問題がない、しかし、サンプルが野生から収集中に発生する可能性がある）破棄されている場合。ない汚染が存在しなくても、メディアが色を変更した場合、これはあまりにも多くの細胞や同じ皿に置かれた非常に多くの組織片のどちらかが原因です。プレートの60％以上が添付された線維芽細胞によって覆われている場合は、プレート上でメディアを変更し、新しいメディアと新しいプレートに組織片を転送する。プレートに接続されていない多くの線維芽細胞の場合、メディアを変更すると2-4プレートに組織片を分割。 </li><li>メディアが先に変更されていた場合、7日後、、メディアを変更し、新しいメディアと新しいプレートに組織片を転送する。 </li><li>追加の7日間の細胞および組織断片をインキュベートする。 14日目では、すべての実行可能な線維芽細胞は、組織断片を終了した。 </li><li>細胞分離の初めから14日後、古いメディアと組織断片を破棄、5 × 10 5細胞/プレートで、新しいプレートに15％FBS、1Xペニシリン/ストレプトマイシンをEMEMを細胞やプレート、それらを収穫する、非必須アミノ酸、およびナトリウムピルビン酸。 EMEMのメディアは、他の種類の細胞が死ぬか、増殖を停止される線維芽細胞の成長をサポートします。 </li><li>細胞が80〜90％コンフルエントに達した後、将来の使用のための細胞のアリコートを凍結する。 </li><li>細胞が80〜90％コンフルエントに達したときに5 × 10 5細胞/プレートで分割しで培養細胞を続ける。 </li></ol> 4。代表的な結果正常な線維芽細胞は顕著な突起（葉状仮足）（図2）を持つ大規模な細胞である。線維芽細胞は単層で増殖。健全な成長の文化は、Mステージの1-10％の細胞が含まれていますように板の表面上に上昇して細胞を切り上げ、ただしプレート（図3）からデタッチされていない認識。通常は、5 × 10 5細胞を接種した10cmディッシュは3-4日でコンフルエントになる。倍加時間は、種間で大きく異なり、そして長寿命のげっ歯類1のいくつかのために大きくなることがあります。細胞は彼らがG1の舞台での増殖を阻止プレートを入力するとき。線維芽細胞の典型的なコンフルエントプレートは、細胞（図4）の密集層が含まれています。細胞が90％コンフルエントに達すると、彼らは、分割するための準備が整いました。必要に応じて、細胞は通常のメディアの変更（週1〜2回）で長時間のための逮捕コンフルエントプレート上で維持することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。マウスの皮膚（）と肺（B）から線維芽細胞の分離。メディアは7日目で写真を撮る前にアタッチされていない細胞と破片を除去するために変更されました。 <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。マウスの肺線維芽細胞。 <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。 10倍の倍率で撮影したM - STAGE内の細胞を含むマウスの線維芽細胞のフィールド、。 <img src="/files/ftp_upload/2033/2033fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。 10倍の倍率で撮影したマウス線維芽細胞のコンフルエントプレート、。

<ol><li>Seluanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+tumor+suppressor+mechanisms+evolve+in+rodent+species+that+differ+in+size+and+lifespan.+Aging+%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging .</a> Cell. 7, 813-823 (2008).</li>
<li>Parrinello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

通常の主な線維芽細胞は、生物学の研究で​​確立された癌細胞株に対する優れた代替手段を提供しています。線維芽細胞の重要な利点は、彼らが癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の変異を運ぶし、無傷の細胞周期チェックポイントを維持していないということです。これは正常な線維芽細胞周期調節、DNA修復、およびアポトーシスの研究に適したシステムです。ここで説明するプロトコルは、分離と一次線維芽細胞の維持のための簡単​​なレシピを提供します。このプロトコルが正常にげっ歯類の20種以上から線維芽細胞を単離するために使用されました。 汚染を避けるために、細胞培養での作業を常に無菌状態を維持することが重要です。研究所はまた、文化など、HeLa細胞などの積極的な癌細胞株をした場合、線維芽細胞はがん細胞とは別に処理する必要があります。それは、初代培養のための指定されたフードとインキュベーターを有することが好ましい。 それは3％の生理的な酸素濃度での初代細胞培養を維持することが望ましい。大気（20％）の文化と増加酸化ストレスの酸素が短く寿命。マウス線維芽細胞は酸化...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>胎仔ウシ血清 (FBS), Qualified</td><td>Invitrogen</td><td>01437-036</td><td>Qualified血清は、初代線維芽細胞に良好な増殖支援を提供することが事前テストで確認されています。</td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤</td><td>Invitrogen</td><td>15420-096</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Liberase TM Research Grade&lt;/strong&gt;</td><td>Roche</td><td>&lt;strong&gt;05401127001&lt;/strong&gt;</td><td>代替酵素</td></tr><tr><td colspan="4">著者からの注意：Roche社がLiberase Blendzyme 3 (11814184001) の販売を中止したため、代わりにLiberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) の使用が推奨されています。我々は、問題なくこの酵素に切り替えました。</td></tr><tr><td>EMEM培地</td><td>ATCC</td><td>30-203</td><td>ATCCのEMEM培地には、非必須アミノ酸とピルビン酸ナトリウムが既に含まれています。</td></tr><tr><td>#21 使い捨て滅菌メス（Feathered）</td><td>複数のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3ガス制御インキュベーター</td><td>Forma または Heraeus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

生物学的研究のために、初代培養細胞ではなく癌細胞株を使用することの重要性は広く認識になりつつあります。がん細胞は、これらのプロセスに関与する遺伝子の変異を運ぶように主細胞は、細胞周期の制御、アポトーシス、およびDNA修復の研究で好まれている。初代細胞は無限に複製老化または異数性発現の発現のために培養することができません。したがって、新しい文化は、定期的に確立する必要があります。齧歯類の胚性線維芽細胞の単離のための手順は十分に確立されているが、成人線維芽細胞培養を単離することはしばしば課題となっています。ヒトの患者から線維芽細胞にそれらを比較するときに、ヒト疾患のモデルマウスから分離された成体げっ歯類の繊維芽細胞は、優先制御があります。妊娠中の女性を容易に得ることができない野生のげっ歯類を操作するときまた、成人線維芽細胞でのみ利用可能な材料です。ここでは、げっ歯類の皮膚や肺から成人線維芽細胞の単離および培養のためのプロトコルを提供しています。我々は、実験用マウスおよびラットからそのようなビーバー、ヤマアラシ、やリスなどの野生げっ歯類20種のげっ歯類上から線維芽細胞を分離するためにこのプロシージャを正常に使用する。

この記事では野生のげっ歯類の皮膚および肺組織からの初代線維芽細胞培養物の分離および保守のためのプロトコルについて説明します。

生物学的研究において、がん細胞株ではなく初代細胞を使用することの重要性が広く認識されるようになっています。初代細胞が好まれるのは...

動物の皮膚および肺組織から生存可能な線維芽細胞を単離するには、まず動物の死体から皮膚と肺の断片を切り出します。無菌操作を用いて、組織を細かく裁断し、コラゲナーゼで消化させます。その後、消化された組織断片を栄養豊富な培養液中でインキュベートし、組織から線維芽細胞が遊出するまで待ちます。最後に、組織片を取り除き、富栄養培地を線維芽細胞増殖培地に交換します。細胞を継代した後、細胞のアリコートを将来の使用に備えて凍結保存します。最終的に、1 cm²の皮膚または肺組織断片から、10の7乗個の継代線維芽細胞が得られます。組織の酵素消化を伴わない他の手法に対する本手法の主な利点は、多様な動物検体から大量の細胞を得られる点にあります。本手法は、比較生物学分野の研究者が、広範な哺乳類種から線維芽細胞を効率的に単離することを可能にします。組織の消化および細切工程は、直感的な操作が必要であり、使用する組織や動物検体によって異なるため、習得が困難です。したがって、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。本手順を開始する前に、ハサミとピンセットを70% ethanolで滅菌し、オートクレーブにかけ、小さなマグネチックスターラーを入れた30 milliliterのビーカーを用意し、Liase Zyme 3溶液の新しい分注量（aliquot）を融解させておいてください。また、細胞培養液を温めておきます。野生動物を扱う際は、狂犬病ウイルスなどの病原体が含まれている可能性があることに留意してください。慎重に作業を行い、常に鋭利な器具の取り扱いに注意してください。この手順を開始するには、動物を安楽死させ、死体を 4 °C で保管します。細胞回収率が低下するため、死体はすぐに使用するか、あるいは 24 時間以内に組織サンプルを採取することが望ましいです。動物の解剖は、手術室または化学薬品用フード内で行い、組織採取用装置内では行わないでください。腋窩の皮膚は薄く、脂肪含有量が少なく、さらに被毛の密度が低いため、クリーンベンチ内で腋窩領域から皮膚サンプルを採取します。まず、切開部位を70% ethanolで洗浄します。被毛がethanolで十分に浸っていることを確認してください。次に、鋭いメスを用いて切開部位周辺の被毛を剃ります。この際、予定している切開部位よりも広い範囲を剃ってください。皮膚を切らないよう細心の注意を払います。除毛後、その部位に70% ethanolをスプレーし、乾燥させます。皮膚サンプルを採取するには、約1cm²の断片を切り出します。組織鉗子で皮膚をつまみ、はさみで切り取ってください。脂肪層は後のコラゲナーゼ消化を妨げるため、皮膚と一緒に脂肪層を切り取らないように注意してください。乾燥を防ぐため、組織片を滅菌PBSを含む50 milliliterチューブに入れます。次に、肺

establishing-primary-adult-fibroblast-cultures-from-rodents

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。...

成体ラットの心筋細胞の初代培養

機械的な力は、肺の開発と肺傷害において重要な役割を果たしています。ここでは、げっ歯類の胎児の肺II型上皮細胞と線維芽細胞を分離するとを使用して機械的刺激にそれらを公開する方法について説明します。...

胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

このビデオでは、出生後のマウスの子犬の皮膚からメラノサイトと線維芽細胞を同時に分離して培養する迅速な方法を説明しています。これらの細胞は、in...

初代マウスメラノサイトおよび線維芽細胞の迅速培養:マウス皮膚サンプル全体からのメラノサイトおよび線維芽細胞の単離

私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。...

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

私たちは、筋線維芽細胞の表現型を持つマウスとヒトの食道間質細胞の初代培養物を生成するためのプロトコルを提示します。培養細胞は紡錘形の形態を持ち、α-SMAとビメンチンを発現し、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞表面マーカーを欠いています。特性評価された間質細胞は、上皮-間質相互作用の機能研究に使用することができます。...

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin...

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

我々は、マウスの耳と尾から初代線維芽細胞を生成するための簡単​​かつ迅速に実験手順を説明します。手順は、特別の動物の訓練を必要とせず、最大10日間室温で保存された耳からの線維芽細胞培養物の生成のために使用することができます。...

マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統...

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

このプロトコルは、0〜4日前マウスの皮膚からメラノサイトおよび線維芽細胞培養物を同時に生成する迅速な方法を概説する。これらの一次培養は、皮膚細胞生物学、色素沈着、創傷治癒および黒色腫を含む様々な生理学的に関連するプロセスを研究するために、インビトロで維持および操作することができる。...

原発性マウスメラノサイトと線維芽細胞培養の急速な生成

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。...

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

学ぶ 野生げっ歯類の皮膚・肺組織からコラゲナーゼ消化を用いてプライマリ線維芽細胞を効率的に分離・培養する方法。この技術は比較細胞生物学研究において有用です。

げっ歯類からプライマリ大人の線維芽細胞培養の確立

さらに動画を探す