0 閲覧数 • 4:55 分 • April 30th, 2023
- オルガノイドは、その起源の器官の主要な組織特性を模倣するように自己組織化する三次元のin-vitro細胞構築物です。標識を開始するには、採取したオルガノイドをタンパク質分解酵素とコラーゲン分解酵素カクテルで処理し、細胞を懸濁液に解離させます。遠心分離機で細胞を酵素含有上清から分離します。上清を捨てます。レンチウイルスベクターを含有する培地を用いて細胞ペレットを溶解します。これらの組換えウイルスは、緑色蛍光タンパク質またはGFPのコード配列を持っています。
ウイルスは細胞と融合し、遺伝物質と特定のウイルス酵素を細胞質に放出します。ウイルス逆転写酵素は、宿主の核に移動する相補的なウイルスDNAを合成します。ウイルスインテグラーゼは、GFP配列を含むウイルスDNAを宿主ゲノムに組み込むのに役立ちます。これらの形質導入細胞を細胞外マトリックスまたはECMコーティング培養プレートで増殖させます。培地を吸引し、遠心分離して、付着していない細胞を回収します。セルを追加のECMに再懸濁します。
懸濁液を接着性培養物に重ねて、細胞の生存率を促進します。マトリックスが固まったら、培地を加えてインキュベートし、オルガノイドの形成を促進します。蛍光顕微鏡で培養物を観察します。形質導入された細胞は緑色蛍光タンパク質を合成します。これらの細胞から形成されたオルガノイドは、GFP陽性を示します。以下のプロトコルは、患者由来の結腸直腸癌オルガノイド細胞へのGFPレンチウイルス形質導入を示しています。
- 7〜10日間の培養後、滅菌細胞スクレーパーでオルガノイドを機械的に取り外し、オルガノイドを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、軽くたたいて別の遠心分離を行います。結腸直腸癌オルガノイドを解離するには、500マイクロリットルのタンパク質分解酵素溶液とコラーゲン分解酵素溶液をチューブに加え、軽くたたいて混ぜます。
室温で10分後、1% FBSを添加した500マイクロリットルの培地を細胞に加え、細胞懸濁液を数回非常に穏やかにピペットで動かしてオルガノイドを分解します。
- 継代中のヒトCRCオルガノイドの穏やかなピペッティングは、培養中の無傷のスフェロイド形成を維持するために重要です。
- 細胞を再度遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルの5x GFPレンチウイルスストックと400マイクロリットルの新鮮な結腸直腸癌オルガノイド培養培地に再懸濁します。
- ヒトCRCオルガノイドに高力価のGFPレンチウイルスを感染させることは、特にほぼ100%の感染効率を達成するために不可欠です。
- 中濃度の500マイクロリットルあたり5倍10〜5番目の解離腫瘍細胞を達成するために各チューブ内の容量を調整し、示されているように人工細胞外マトリックスコーティングされた12ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの細胞をプレートします。細胞培養インキュベーターで18時間後、浮遊する細胞含有上清を個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移して遠心分離し、続いてペレットを氷上のチューブあたり70マイクロリットルの人工細胞外マトリックスに再懸濁します。
結腸直腸癌細胞の生存率を高めるには、腫瘍細胞を含む人工細胞外マトリックスを12ウェルプレートの腫瘍オルガノイドに重ね合わせ、プレートを細胞培養インキュベーターに30分間置きます。人工細胞外マトリックスコーティングが固まったら、1% FCSを添加した1ミリリットルの新鮮なCRCオルガノイド培養培地を培養物に供給し、細胞を細胞培養インキュベーターに3日間戻します。次に、感染した細胞を蛍光顕微鏡で観察して、ほぼ100%のGFP陽性を確認し、さらに4〜6日間細胞をインキュベーターに戻します。