0 閲覧数 • 5:19 分 • April 30th, 2023
- まず、変異させる目的の腫瘍抑制遺伝子に隣接するLoxPインサートと呼ばれる特定のCre-recombinase酵素認識配列を持つ改変ゲノムを持つ麻酔をかけた条件付き変異マウスを採取することから始めます。外科的に腹腔を露出させます。遠位結腸の位置を特定し、その上部をクランプします。経肛門的に医療グレードのチューブを挿入し、それを遠位結腸に進めます。結腸を生理食塩水で洗い流して、糞便を取り除きます。チューブを交換してください。セグメンテーションのために結腸の下部領域をクランプします。適切な細胞解離溶液を使用してセグメントを膨らませます。これにより、粘膜バリアが穿孔され、腸の陰窩細胞のアクセシビリティが向上します。解離液を洗い流します。
次に、アデノウイルス懸濁液を結腸セグメントに注入します。これらの遺伝子操作されたウイルスベクターは、Cre-リコンビナーゼ酵素をコードしています。ウイルスは細胞に侵入し、そのDNAを核に放出し、酵素を発現します。このタンパク質は、宿主ゲノムのLoxPインサートを認識し、部位特異的な組換えを触媒することで、腫瘍抑制遺伝子を不活性化します。この機能喪失変異は、がんの進行を促進します。切開部を縫合し、マウスが回復するのを待ちます。孤立した結腸直腸腫瘍の成長を観察するために監視します。次のプロトコルは、分節性アデノクレ感染による結腸直腸癌モデルマウスの生成を示しています。
- 麻酔をかけたマウスを仰臥位に置くことから始め、動物の目に軟膏を塗ります。マウスを固定位置にテープで固定し、つま先をつまんで適切な鎮静レベルを確認します。下腹部の皮膚に約15ミリメートルの正中線切開を行います。次に、鉗子を使って腹壁の筋肉をつかみ、ハサミで筋肉を丁寧に切開して腹腔を開きます。遠位結腸を特定した後、肛門の近位に約15ミリメートルの繊細なクランプで組織を慎重にクリンチします。
次に、柔軟なテフロンチューブを経肛門的に挿入し、管腔閉塞に達するまでチューブを慎重に進め、30ゲージのカニューレでチューブをカニューレします。標準の1ミリリットルの注射器をカニューレに接続し、すべての糞便が排出されるまで、数ミリリットルの通常の生理食塩水で結腸を洗い流します。遠位結腸が空になったら、生理食塩水チューブを新しいテフロンチューブと交換し、2番目のクランプを使用して、最初のクランプから約3ミリメートル離れた結腸を閉塞します。
30ゲージのカニューレを装備した2番目の1ミリリットルの注射器を使用して、クランプされた結腸セグメントに50〜80マイクロリットルの0.25%トリプシンEDTAを慎重に注入します。結腸は、固定された組織セグメントを穿孔することなく粘膜バリアを破壊するのに十分なほど膨らむ必要があります。10分後、遠位clを取り外しますamp。次に、トリプシンチューブを取り外し、遠位結腸を500マイクロリットルの生理食塩水で洗い流します。
新しいテフロンチューブを挿入した後、結腸を再度クランプし、50〜80マイクロリットルのアデノウイルス溶液で組織を膨らませます。30分後、クランプとチューブを取り外し、6-0の急速に吸収されるランニング縫合糸で腹壁を閉じます。外科用創傷クリップで皮膚を閉じ、動物が完全に回復するまで加熱パッドで動物を監視します。
大腸内視鏡検査で腫瘍の成長をモニターするには、麻酔をかけた腫瘍担存動物を温熱パッドの仰臥位に置き、内視鏡を腸管に経肛門的に挿入します。視線制御下で空気を静かに膨らませ、結腸を膨張させます。次に、遠位結腸で粘膜病変が特定されるまでスコープを慎重に前方に押し込み、取得された各内視鏡画像を後で評価するために保存します。すべての画像を取得したら、内視鏡をゆっくりと取り外し、完全に回復するまでマウスを摂氏38度の加熱パッドに置きます。