CRC細胞におけるホスファターゼアッセイ:結腸直腸癌細胞におけるタウタンパク質のリン酸化状態を調べる方法

- タウタンパク質は、結腸直腸癌細胞の核小体に周辺的に局在し、核小体構造の維持に役立ちます。ほとんどの場合、これらの細胞は過剰にリン酸化されたタウタンパク質を発現し、その結果、薬剤耐性が生じます。したがって、ホスファターゼアッセイを実施することにより、タウリン酸化のレベルを分析します。

まず、ヒト結腸直腸癌細胞からの総タンパク質を含む細胞溶解物を、テストおよびコントロールとラベル付けされた2つのバイアルに取ります。試験サンプルをアルカリホスファターゼ酵素で処理します。アルカリホスファターゼはタウからリン酸基を除去しますが、コントロールバイアルはリン酸化タウタンパク質を保持します。

次に、サンプルとコントロールタウの両方をポリアクリルアミドゲル上で分析し、タンパク質を分離します。リン酸化タウは、非リン酸化タウタンパク質よりもゲル上をゆっくりと移動します。タンパク質サンプルを適切なメンブレンにエレクトロブロットし、リン酸化タウと正常タウの両方に対応する一次抗体を添加します。

ブロットを一晩インキュベートします。一次抗体のFc領域に結合するレポーター酵素標識二次抗体でブロットを処理してください。最後に、化学発光基質を使用してブロットを現像し、ブロット中に存在する全タンパク質サンプルからタウタンパク質を同定します。次のプロトコルでは、CRC細胞におけるタウの全体的なリン酸化状態を評価するためのホスファターゼアッセイを実演します。

- 総タンパク質の20マイクログラムを含むサンプルを調製した後、アルカリホスファターゼ緩衝液の2マイクロリットルとアルカリホスファターゼの10マイクロリットルをそれぞれに加える。次に、各サンプルの最終容量が20マイクロリットルになるように蒸留水を追加します。

サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。サンプルをインキュベートしている間に、同じ濃度で追加のサンプルを調製しますが、比較のためにホスファターゼは使用しません。1時間後、最終濃度50ミリモルのEDTAまたは最終濃度10ミリモルのオルトバナジン酸ナトリウムを添加して反応を停止します。

新たに調製した4X SDSゲルローディングバッファーに400ミリモルDTTを添加します。ヒートブロックを使用して、サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートします。サンプルをボルテックスし、室温で10〜15分間冷却します。

次に、ウェルあたり13マイクロリットルのサンプルと分子量ラダーを10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動システムを電源に接続し、電圧を70ボルトに20分間設定して、タンパク質サンプルをスタッキングゲルから分離ゲルに移動します。

この後、125ボルトに増やし、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。湿式エレクトロブロッティングシステムを使用して、ゲルをポリフッ化ビニリデンメンブレンに100ボルトで約100分間移します。

次に、メンブレンをインキュベートして、室温で90分間4%ウシ血清アルブミンにブロットします。ブロットを一次抗体溶液(摂氏4度)で一晩インキュベートします。翌日、ブロットをPBSTで3回、毎回7分間洗浄します。

関連する二次抗体溶液で室温で90分間インキュベートします。その後、PBSTで4回、各洗浄は7分間続きます。メーカーの指示に従って、化学発光キットを使用してブロットを現像します。

現像したブロットを透明なラップで覆い、市販の化学発光イメージングシステムでブロットの化学発光画像を取得します。