0 閲覧数 • 4:28 分 • April 30th, 2023
- タウは、微小管の安定化と組み立てに関与する微小管関連タンパク質です。多くのがん細胞は、過剰にリン酸化されたタウタンパク質を発現し、これはよく組織化された微小管結合を維持することができません。タウタンパク質と微小管との相互作用を研究するには、タウタンパク質を含むがん細胞溶解物と微小管のワーキング溶液をマイクロチューブに加えます。
細胞溶解物中に存在する非リン酸化タウタンパク質は、微小管に結合します。次に、チューブ内に必要な量のPEMバッファーを添加して、フィラメントに重合して微小管を形成するタンパク質であるチューブリンの活性を安定させます。混合物を所望の期間インキュベートする。
混合物を遠心分離して、微小管結合タンパク質をペレット化します。未結合のタンパク質は上清に残ります。上清を新しいチューブに移し、ペレットを適切な緩衝液に再懸濁します。再懸濁したペレット懸濁液にゲルローディングバッファーを添加し、ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを泳動して、微小管結合タンパク質とエレクトロブロットを適切なメンブレン上に分離します。
適切な抗体を添加し、化学発光基質を使用してブロットを現像し、結合したタウタンパク質を同定します。次のプロトコルでは、微小管結合タンパク質を同定するために微小管結合アッセイを行います。
- 新鮮なサンプルを調製した後、摂氏37度で30分間インキュベートします。サンプルを100,000 x g、摂氏25度で60分間超遠心分離します。次に、結合していないタウを含む各上清の120マイクロリットルを、清潔で標識されたチューブを分離するために移します。結合したタウを含むペレットに120マイクロリットルの5Xサンプルバッファーを加えます。
ボルテックスとピペッティングで十分に混合した後、混合物を清潔な標識チューブに移します。同等のタンパク質濃度のサンプルを調製した後、400ミリモルのDTTを含む新鮮な4X SDSゲルローディングバッファーを添加します。ヒートブロックを使用して、サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートします。
サンプルをボルテックスし、室温で10〜15分間冷却します。ウェルあたり13マイクロリットルのサンプルをロードし、分子量ラダーを10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動システムの正極と負極を電源に接続し、電圧を70ボルトに20分間設定します。
この後、125ボルトに増やし、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。湿式エレクトロブロッティングシステムを使用して、ゲルをポリフッ化ビニリデンメンブレンに100ボルトで約100分間転写します。メンブレンをインキュベートして、室温で90分間4%ウシ血清アルブミンでブロットします。その後、一次抗体溶液で4°Cで一晩インキュベートします。
翌日、ブロットをPBSTで4回洗浄し、各洗浄を7分間続けます。洗浄したブロットを関連する二次抗体溶液で室温で90分間インキュベートします。その後、PBSTで7分間、合計4回洗濯を繰り返します。化学発光キットを使用してブロットを現像します。透明なラップで覆い、化学発光イメージングシステムを使用して画像を取得します。