JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:53 分 • April 30th, 2023
- 結腸直腸癌の3D器官型モデルは、生体内の腫瘍微小環境を模倣するように操作されたinvitro培養物です。培養物には、結腸直腸癌上皮細胞と共培養された線維芽細胞のような間質細胞が、適切な細胞外マトリックス微小環境で含まれていることがよくあります。
確立された培養物では、転移の可能性のある腫瘍細胞が細胞外マトリックスに侵入します。これらの侵入細胞を単離するには、まず、器官型モデルをホルムアルデヒドで処理して、細胞と細胞外マトリックスを固定します。アルコールとインキュベートしてサンプルを脱水します。
次に、流動パラフィンワックスに埋め込んでティッシュブロックを作製します。ウルトラミクロトームを使用して、薄くスライスした切片を取得します。セクションを適切なスライドガラスに取り付けます。
キシレンを加えて切片を脱パラフィンします。順次、エタノールの濃度が減少する中で切片をインキュベートし、サンプルを再水和します。
Cresyl Violetで治療して、結腸直腸癌細胞を微小環境から染色し、区別します。ステンドグラスのスライドを下にして顕微鏡ステージに置きます。適切なソフトウェアを使用して、マイクロダイセクションする細胞を特定し、境界を描きます。レーザーを発射して強調表示された部分を切断し、マイクロダイズされた部分を収集します。
次のプロトコルでは、レーザーマイクロダイセクションによる3D器官型共培養モデルからの結腸直腸癌細胞の単離を示します。
- ナイロンシートを含む有機型全体をウェルから取り出し、ラップフィルムの上に置きます。清潔な使い捨てメスを使用して器官型シートとナイロンシートを二等分し、両方の半分をホルムアルデヒドで室温で24時間固定します。24時間後にホルムアルデヒドを70%エタノールに交換し、パラフィンに包埋、切片化、染色する前に一晩放置します。
レーザーマイクロダイセクションを実行するには、まず、器官型を10ミクロンの厚さに切片化し、メンブレンマウントスライド上に載せます。テキストプロトコルに記載されているように切片を処理した後、選択したプラットフォームを使用してレーザーマイクロダイセクションを実施する準備をします。
顕微鏡解剖するステンド部分のあるスライドガラスを下向きにして顕微鏡ステージに置きます。0.5ミリリットルの微量遠心チューブを収集カセットに取り付け、50マイクロリットルの細胞溶解バッファーをキャップに追加して、微小解剖した組織が収集します。直視下で、ジョイスティックを使用して目的の組織を特定し、ソフトウェアインターフェースを使用して、染色された有機切片に注釈を付け、腫瘍浸潤フロントでマイクロダイセクションされる細胞を強調表示します。
レーザーに発射を指示すると、強調表示された部分が切り取られ、マイクロ解剖された組織がマイクロ遠心チューブのキャップに推進されます。適切な方法でサンプルを処理し、目的の分析物を抽出します。