0 閲覧数 • 4:23 分 • April 30th, 2023
- 静止期のメラノサイト幹細胞は、紫外線や毛の脱毛に反応して活性化します。活性化された黒色腫幹細胞は、皮膚がんの一種である皮膚黒色腫を引き起こす可能性があります。メラノーマを研究するために、固定手順中にDNAとタンパク質の天然構造を保持するために、凍結皮膚組織ブロックを準備します。
まず、安楽死させた黒色腫マウスを手術用ベッドに置き、尾の上の皮膚の背側領域から毛を取り除きます。皮膚を切除し、濾紙で覆います。次に、皮膚組織を含む濾紙を中性緩衝ホルマリンに所望の時間沈めます。ホルマリンは皮膚組織に浸透してアミノ酸に結合し、タンパク質の架橋を引き起こし、組織固定につながります。
紙から皮膚ティッシュを取り除き、ティッシュを切って目的のサイズのピースを取得します。次に、OCT培地で満たされたクライオモールドにティッシュピースを垂直に埋め込み、クライオモールドをドライアイスの上に置きます。OCTは、凍結すると固化し、組織標本の周囲にゼラチン状の層を形成して所定の位置に保持する標本マトリックスです。凍結ブロックは、さらなる組織学的アッセイに使用します。次のプロトコルでは、マウスの背側皮膚から凍結皮膚組織ブロックを準備して、皮膚黒色腫を研究します。
- 皮膚サンプルを分離するには、電動トリマーを使用して、安楽死させた照射マウスの背側の皮膚領域から毛を取り除き、露出した皮膚を糸くずの出ないティッシュで軽くブラッシングして領域をクリアします。尾の付け根のすぐ上に鋭利なハサミで小さな切開を行い、その切開部に大きな鈍いハサミを挿入して皮下結合組織を分離します。鋭利なハサミを使用して、関心のある皮膚領域の端に沿って慎重に切り取り、組織サンプルを分離し、切除した皮膚組織を清潔なペーパータオルの上に置きます。
次に、鈍い鉗子を使用して皮膚を伸ばし、タオルに密着してピンと張るようにします。すべてのサンプルを採取したら、皮のサンプルとペーパータオルの裏地を折り目のすぐ隣の折りたたまれた濾紙に入れ、サンプルが滑らかで折りたたまれたりしわくちゃになっていないかに注意してください。濾紙の側面をホッチキスで閉じ、紙をトリミングします。次に、サンプルを室温で3〜5時間中性緩衝ホルマリンに完全に沈めてから、脱イオン水で組織を5分間の洗浄を2回行います。
2回目の洗浄後、皮膚組織から残留物を慎重に取り除き、サンプルの端がギザギザにならないようにトリミングします。次に、ストリップの幅が5ミリメートル以下になるように各サンプルに3つの矢状カットを行い、サンプルの幅が20ミリメートル以下になるように横方向のカットを行います。最適な切断温度またはOCT培地を含むクライオモールドを縦向きに配置し、OCTの上に4〜5枚の皮膚を置きます。
すべてのピースが所定の位置に配置されたら、2対の細い鉗子を使用して、各スキンピースの長辺をクライオモールドの底に持ってきて、サンプルがOCT内で垂直になり、モールドのベースに対して垂直になるようにします。次に、2番目の唇に追加のOCTを型に充填し、ドライアイスの平らな面に型を置き、鉗子を使用して、ブロックが必要に応じて凍結し始めるときに転写中にずれた可能性のある皮膚片を調整します。