Name: マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶマウス胎児肺の分離培養法。上皮間葉相互作用を観察し、FGF9処理による形態変化を解析。発生生物学と再生医療研究に有用な器官培養技術です。

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この作品は、サバン研究所プリ博士賞（PMDM）によってサポートされており、NIH RO1 HL75773（DW）でした。

器官培養は、遺伝子やタンパク質の発現を研究するために非常に有用かつ汎用性の高いテクニックです。これらのex vivoの培養方法は、予備として、またはin vivo試験を補完するものに使用することができます。 1。胎児肺の分離<ol><li>時限妊娠マウスは、NIHとOLAWガイドラインにしたがってCO 2ナルコーシスでpostcoitum日11.5または12.5（E11.5 - 12.5）に屠殺されています。動物は、チャンバ内に配置されており、100％のCO 2が導入されています。動物が意識不明になった後、CO 2流量が増加しています。動物の臨床死が確保されなければならない。 </li><li>すべての次の手順では、層流フードで無菌条件下で完了する必要があります。子宮は妊娠した女性から削除されます。動物から子宮を削除するには、妊娠中の女性は彼らの後ろに配置され、70％エタノールを噴霧されています。切開は、腹部に行われ、皮膚は動物の後ろ足を押しながら上方に皮膚を引っ張って削除されます。腹腔が開かれると子宮が動物から削除されます。 </li><li>血液を50 mlコニカルチューブ冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で満たされた、そしてチューブを静かに2分間揺動さで子宮を置くことによって洗い流したされる。 </li><li>子宮は、立体的な解剖顕微鏡下でペトリ皿に入れ、そして胚は、春のはさみを使用して子宮壁を切開によって子宮から放出される。胚は、穴あきスプーンを使って回収し、HBSSを含む新しいペトリ皿に氷の上に配置されます。 </li><li>立体解剖顕微鏡下では、胚の肺は、冷HBSS（図1）を含むペトリ皿に一つずつ解剖されています。 </li><li>分離された胎児肺を無菌トランスファーピペットを使用してHBSSを含むペトリ皿に氷の上に配置されます。 </li></ol> 2。胎児肺の文化<ol><li> 1ミリリットルにウェルあたりD-MEM/F-12 500マイクロリットルがペニシリン - ストレプトマイシンを50単位/ mlを添加したがNunclonポリスチレン皿に追加されます。 </li><li> Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンは、メディアの上に配置されます。 Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンは、メディアの上に配置されると、光沢のある面は、メディア、そしてラフサイド上を向いている反対であることを確認してください。 </li><li>解剖胎児肺を無菌トランスファーピペットを使用してNucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンの上に配置されます。 </li><li>胎児肺の位置は、鉗子を用いて調整されます。フィルター上に配置胎児肺はそのまま気管を持つ必要がありますし、ストレートポジションを持つ彼らの気管を配置して、したがって、すべての肺が同じ内圧ができるようになります。 </li><li> Nunclonのポリスチレンディッシュは、細胞培養器（図2）で目的の培養時間のために転送されます。 </li></ol> 3。材料 1。胚性肺全体の分離<ol><li>時限妊娠（C57BL6野生型またはトランスジェニック）マウス13.5（E11.5 - 13.5）にpostcoitum日11.5に犠牲になる。 </li><li>ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）（1X）、液体、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、または硫酸マグネシウムなし。 （Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）50単位/ペニシリン - ストレプトマイシンのML（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を補充した。室温と4℃で開栓後はHBSSを保管してください。分注して保管-20℃でペニシリン - ストレプトマイシン</li><li>立体解剖顕微鏡（ライカ、ヴェッツラー、ドイツ）。 </li><li>デュモン鉗子、ファインアイリスハサミ（ストレート）、ノイス春はさみとモリア®スプーン（穴あき）（ファインサイエンスツール、フォスターシティー、CA）を含む解剖ツール。 </li></ol> 2。胚性肺全体の文化<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地：栄養がミックスF - 12（D-MEM/F-12）（1X）、液体、1:1はL -グルタミン、ないHEPES緩衝液が含まれています。 （Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）50単位/ペニシリン - ストレプトマイシンのML（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）を補充した。 4で光を避けDMEM/F-12ボトルをキープ（例えばアルミ箔でカバー）と店舗℃の分注して保管-20℃でペニシリン - ストレプトマイシン</li><li> Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレン、8.0 - M、13ミリメートル（ワットマンNucleporeトラックエッチメンブレン（ワットマン、フォーハムパーク、ニュージャージー州）。 </li><li>蓋付きNunclonポリスチレン皿、4ウェル（ロチェスター、ニューヨーク州）。 </li><li>使い捨て転送ピペット、滅菌（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA）。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 E12胎児肺の解剖。 （）E12.5全胚では右側から見た。（B）右前肢は胚から削除されています。皿に胚を固定左手によって保持される（C）鉗子。矢印は、（D）胚の肺は、心臓（除去の後方にある解剖の計画を示す）と脊椎の前方。この図は、肌と心の除去の後に肺を示しています。（E）咽頭除去が胚から無傷の肺の分離を可能にする。（F）余分な咽頭組織と食道を離れてトリミングされています。無傷の気管と喉頭との解剖E12.5胎児肺が表示されます。 （Cr）が頭蓋側頭葉、（メッド）中葉、（Ca）の尾部ローブ、（ACC）副肺、（ル）左葉。 <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。E12.5肺がFGF9のない状態で48時間成長させた。FGF9は、間充織の拡大を誘導し、肺の上皮の拡張は、in vitroで増殖させた。（AC）分岐の増加に注意してください。（DF）E12.5肺はFGF9の存在下で48時間増殖させた。文化の24時間後、早ければ上皮と間充（E）の拡張に注意してください。 48時間（F）の後、上皮への影響はさらに顕著です。スケールバー：AF400μmである4。 この実験的なアプローチのための完全なテキストのプロトコルがで可能です<a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">シュプリンガープロトコル</a> 。

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

肺原初の仕様だけでなく、分岐形態形成、および様々な肺の細胞系譜の形成は、その周囲の間充織と中皮と肺の内胚葉の特定の相互作用を必要とします。肺間葉は、肺の分岐形態形成のための誘導信号の源であることが示されている。上皮 - 間葉 - 中皮相互作用はまた、胎児肺の形態形成に重要です。初期の胎児肺の器官培養では、上皮 - 間葉相互作用を研究するために非常に便利なシステムです。容易に（母親の影響と血流が途絶えることで）このシステムで操作可能な特定の条件下での上皮と間葉の両方の形態形成が進行する。さらに重要なことは、この手法は容易にserumless、化学的に定義された培地で行うことができます。関数のゲインと損失が発現したタンパク質、組換えウイルスベクターおよび/またはトランスジェニックマウスの系統、アンチセンスRNAだけでなく、RNA干渉の遺伝子ノックダウンの解析を使用して達成することができます。

初期の胎児肺の器官培養では、上皮 - 間葉相互作用を研究するために非常に便利なシステムです。容易にこのシステムで操作可能な特定の条件下での上皮と間葉の両方の形態形成が進行する。

肺原基の指定、分枝形態形成、および各種の肺細胞系譜の形成には、...の特異的な相互作用が必要です。

このビデオでは、マウス胚肺の摘出および培養方法を実演します。まず、E 11.5またはE 12.5の胚を採取します。次に、胚を切り開き、肺を摘出します。次に、肺を気液界面（liquid air interface）でプレートに播種し、培養後にインキュベートします。特定の処理に対する胚肺の間充織および上皮の成長と分枝の変化を、実体顕微鏡を用いて観察することができます。こんにちは、デビッド・ウォー・バートンです。私はロサンゼルスのBan Research Institute Children's Hospitalで、発生生物学および再生医療プログラムの責任者を務めております。そして私は、War Burton博士の研究室のシニアポストドクターであるJan Carroです。本日は、マウスの胚性肺を分離し、器官培養に供する手法について解説します。この手法は、約20年前にUSC歯学部でTina Jaco Halkin氏とPablo氏によって最初に行われた記述から発展したものです。当研究室では、肺の分枝形態を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。妊娠11.5日または12.5日のマウスを二酸化炭素で安楽死させ、ラミナーフローフード内で仰向けに置きます。70% ethanolをスプレーし、腹部を切開します。次に、動物の後肢を保持しながら、皮膚を上方に引き上げて除去します。腹腔を開き、子宮を取り出します。冷やしたHanks平衡塩溶液（HBSS）を満たした50 mLコニカルチューブに子宮を入れ、2分間緩やかに揺らして血液を洗い流します。次に、実体顕微鏡下で子宮をペトリ皿に移します。スプリング scissors を使用して子宮壁を切開し、胚を放出させます。その後、ホールプレートを用いて胚を回収し、HBSSを含むペトリ皿に入れて氷上に置きます。実体解剖顕微鏡下での作業を続け、胚肺の解剖を開始します。まず、胚を左側を下にして置きます。左手にピンセットを持ち、右前肢を取り除きます。肢の開口部から胚を切開し、皮膚を取り除きます。この手順により、内臓を確認し、次のステップに向けて心臓と肺の位置を特定することができます。その後、心臓を取り出します。胚肺は心臓の後方、脊椎の前方に位置しています。次に、胚から肺をそのまま分離します。その後、不要な組織と食道を切り取り除いてください。肺を摘出した後、滅菌済みの転送ピペットを使用して、氷上の冷たいHBSSが入ったペトリ皿に肺を移します。クローン形成を抑制したデルタポリスチレン製ディッシュの各ウェルに、50 units/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを添加したD-M-E-M-F 12を0.5から1 mL分注します。次に、ヌクレオポリカーボネート製トラックエッチ膜を、光沢のある面を下、粗い面を上にして培液の上に配置します。滅菌転送ピペットを用いて、解剖した胚性肺を核孔ポリカーボネートトラックエッチ膜の上に置きます。実体顕微鏡を使用して、胚性肺の位置を調整します。胚性肺の気管が損傷しておらず、ここに示すように直線状に配置されている必要があります。すべての肺が同じ内圧になるようにし、ディッシュを細胞インキュベーターに移して目的の時間まで培養します。ここでは、E 12.5の肺をFGF9の存在下または非存在下で培養しました。FGF9は線維芽細胞増殖因子ファミリーの一員であり、in vitroで48時間培養した肺において、間質の拡張および上皮の拡張を誘導します。FGF9が不在の場合、分枝の増加が見られます。これらの画像は、実体顕微鏡下で撮影した胚性肺の写真です。対照的に、FGF9存在下で48時間培養した肺では、上皮の拡張と網状構造が認められます。24時間の培養後。48時間後には、上皮への影響がさらに顕著になります。以上で、マウス胚肺の器官培養の調製方法について説明しました。この手順を行う際は、組織の劣化を抑えるため、できるだけ早く胚から肺を取り出すことが重要です。ご視聴ありがとうございました。この手法がお役に立てば幸いです。実験の成功を願っております。

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