組換えメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)ビリオン調製:高力価組換えMCPyVビリオンを作製する技術

- メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)は、皮膚がんの一種であるメルケル細胞がんを引き起こす環状ゲノムを持つ二本鎖DNA腫瘍ウイルスです。MCPyVビリオンを調製するには、まず、トランスフェクション剤、ウイルスゲノム、およびウイルス複製の促進に必要なタンパク質をコードする2つの発現プラスミドを含むカクテルで、パッケージング細胞の接着培養物を処理します。

インキュベーション中、トランスフェクション試薬はプラスミドとリポプレックスを形成し、パッケージング細胞への送達を促進します。核内に入ると、細胞機構はウイルスおよびプラスミドゲノムの発現を可能にします。発現プラスミドは、大腫瘍抗原および小腫瘍抗原タンパク質をコードしています。これらのタンパク質は核に移動し、ウイルスDNAの複製を促進します。その後、ウイルスゲノムは構造的なキャプシドタンパク質をコードします。これらのタンパク質は核内に移動し、組換えビリオンの組み立てを助けます。

次に、培養した細胞を回収します。洗剤とDNaseを含む溶液でそれらを処理します。洗剤は細胞を溶解してウイルスを放出します。DNaseは、懸濁液から遊離プラスミドDNAを分解します。遠心分離機でペレット内の細胞破片を分離します。ウイルス含有上清を、適切な密度勾配培地を含んだチューブに入れます。遠心分離機にかけ、グラジエント培地内に濃縮されたビリオンリッチ画分を得ます。

次のプロトコルでは、293TT細胞を使用した高力価組換えMCPyVビリオンの調製を示します。

- 午後遅くまたは夕方に、600万個の293TT-28細胞を、補充されたDMEM培地を含む10センチメートルの皿に播種します。摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。翌朝、細胞が約50%コンフルエントであることを確認します。次に、66マイクロリットルのトランスフェクション試薬、12マイクログラムの再ライゲーションMCPyV分離物R17b DNA、8.4マイクログラムのST発現プラスミドpMtB、および9.6マイクログラムのLT発現プラスミドpADLを細胞にトランスフェクションします。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素とインキュベートします。

翌日、トランスフェクションされた細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞をトリプシン化し、15センチメートルのディッシュに移して拡大を続けます。その皿がほぼ合流したら、細胞を3つの新しい15センチメートルの皿に移します。これらの新しいディッシュがほぼコンフルエントになったら、テキストプロトコルで概説されているように細胞を採取します。180 x g、室温で5分間遠心分離します。次に、上清を取り除き、1細胞量のDPBS-Mgを加えます。

25マイクロモルの硫酸アンモニウムを添加し、続いて0.5%のTriton X-100、0.1%のベンゾナーゼ、および0.1%のATP依存性DNaseを添加します。よく混ぜ合わせ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、混合物を氷の上で15分間冷却します。次に、0.17容量の塩化ナトリウムを追加します。混合し、さらに15分間氷上でインキュベートします。12000 x g、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清が透明でない場合は、チューブを静かに反転させ、遠心分離を繰り返します。

この後、上清を新しいチューブに移します。ペレットを0.8モルの塩化ナトリウムを添加した1容量のDBPSに再懸濁します。12000 x g、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清が透明でない場合は、チューブを静かに反転させ、遠心分離を繰り返します。2つの上清を結合し、4°Cで12000 x gで再び10分間遠心分離します。

次に、ピペットを使用して、テキストプロトコルで概説されているように、iodixonalの勾配を薄肉の5ミリリットルポリアロマーチューブに沈着させます。調製したiodixonal勾配の上に、清澄化されたウイルス含有上清の3ミリリットルをロードします。SW55tiローターを234,000 x g、摂氏16度で3.5時間遠心分離し、加速と減速を低速に設定してください。超遠心分離が完了したら、シリコン処理チューブに12個のフラクションを回収します。