初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変:組換えレトロウイルスを用いたケラチノサイトを遺伝子操作する方法

- ケラチノサイトは、表皮または皮膚の最外層に存在する顕著な細胞タイプです。ケラチノサイトを遺伝子組み換えするには、まずレトロウイルスパッケージングフェニックス細胞の培養から始めます。続いて、目的の遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターとトランスフェクション試薬を含む混合物を添加します。プレートを希望の時間インキュベートします。

トランスフェクション試薬は、パッケージング細胞へのウイルス遺伝物質の送達を促進します。これらの特別に設計された細胞は、レトロウイルスカプシドの産生に必要なタンパク質をコードし、目的の遺伝子を運ぶレトロウイルスベクターRNAのパッケージングを促進します。パッケージングすると、成熟したウイルスが細胞から培地に排出されます。次に、ウイルスを懸濁した培地を、初代ケラチノサイトを含む新鮮な培養皿に移します。所望のカチオン性ポリマー溶液で培養物を増強します。

カチオン性ポリマーは、ウイルスおよびケラチノサイト膜の負電荷を中和し、細胞表面とのウイルス融合の効率を高めます。融合すると、ウイルスはそのRNAを細胞質に放出し、細胞質は二本鎖DNAに逆転写します。このウイルスDNAは核に入り、ケラチノサイトゲノムと統合され、遺伝的変化を引き起こします。次のプロトコルでは、レトロウイルストランスフェクションを使用した初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変を示します。

- トランスフェクションの前日に、完全培地中のフェニックス細胞をウェルあたり800,000細胞の密度で6ウェルプレートに播種します。トランスフェクション当日は、トランスフェクションするウェルごとに6マイクロリットルのトランスフェクション試薬と100マイクロリットルのDMEMを混合し、室温で5分間インキュベートします。トランスフェクションする各ウェルについて、3 μgのレトロウイルスベクターを含むチューブに混合物を加え、室温で30分間インキュベートします。この混合物全体をフェニックス細胞の各ウェルに滴下し、細胞を一晩インキュベートします。

トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を取り出し、2ミリリットルの新鮮な完全培地を加えます。同じ日に、ケラチノサイト無血清培地に初代ヒトケラチノサイトを再懸濁し、抗生物質とシードをウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに播種します。

翌日、トランスフェニックス細胞からのウイルス粒子を含む培地を回収します。シリンジを使用してメディアを0.45ミクロンフィルターに通し、汚染された細胞を除去します。ろ過したウイルス含有培地に1ミリリットルあたり5マイクログラムの臭化ヘキサジメトリンを添加して、感染プロセスを仲介します。

次に、前日に播種したケラチノサイトに2ミリリットルのウイルスをピペットで移します。次に、6ウェルプレートを遠心分離機で200 x gで室温で1時間回転させます。回転後、ウイルスを含むメディアを取り出して廃棄します。細胞を1x PBSで一度洗浄し、次に新しいKCSFMを追加します。翌日、示した手順を使用して、同じバッチのケラチノサイトにウイルスを感染させます。