ケラチノサイトコロニー形成アッセイ:ケラチノサイトのコロニー成長能力を評価するためのIn Vitroアッセイ

- コロニー形成アッセイは、個々の細胞が増殖してコロニーを形成する能力を決定します。まず、培養プレートでマウス背側の皮膚を切除します。皮膚の腹側から皮下組織と脂肪をこすり落とします。組織を消化液で処理します。溶液中のタンパク質分解酵素は細胞外マトリックスを分解し、表皮細胞の解離を誘導します。

表皮層をそっとこすり落とし、解離した細胞と毛を採取培地に放出します。適切なストレーナーで懸濁液をろ過し、毛や破片を捕捉し、表皮細胞の単一細胞懸濁液を取得します。この細胞懸濁液の所望の量を、増殖停止フィーダー細胞の接着層を含むコラーゲンコーティングプレートに移します。ケラチノサイトの生存を促進する適切な培地を補充します。

培養中、ケラチノサイトはフィーダー層に付着します。さらに、これらのフィーダー細胞は成長因子を分泌し、ケラチノサイトの成長をサポートする細胞外マトリックスタンパク質を合成します。個々のケラチノサイトの増殖能力に応じて、それらはコロニーを形成し始めます。メディアを取り外し、コロニーを修理します。適切な色素で細胞を染色し、コロニーを検出してカウントします。次のプロトコルでは、試験化合物による処理後に成体マウスから採取した初代ケラチノサイトのクローン形成アッセイを実施します。

- 安楽死させた成体マウスから背側皮膚サンプルを採取した後、オートクレーブ滅菌した鉗子とメスを使用して、一度に1つの背側皮膚を毛むくじゃらを下にして薄いシャーレに入れ、皮下組織を削り取ります、皮膚組織の腹側から脂肪を含む皮下組織を、組織が半透明になるまで。

この削り取ったスキンを、他のすべての残りのスキンが処理されるまでPBSに入れます。次に、メスを使用して、皮膚サンプルを0.5 x 1〜1.5センチメートルのストリップにスライスします。サンプルを上向きにして滅菌ペトリ皿にストリップの毛むくじゃらの面を上に置き、サンプルを毛むくじゃらにして、プラスチックの100×20ミリメートルのペトリ皿に0.25%トリプシンを添加した2xゲンタマイシン溶液の表面に浮かべます32°Cで2時間。

インキュベーションの終わりに、15ミリリットルの収穫培地が入った滅菌プラスチック製の正方形のペトリ皿を30度の傾斜に置き、湾曲した鉗子を使用して浮遊する皮膚ストリップを慎重に皿に移します。新しいメスの刃を皮膚に対して垂直な角度で保持し、十分な力を使用しますが、過度の力を加えずに、サンプルの表皮と毛をこすり落とします。

すべてのストリップがこすり落とされたら、表皮細胞を含む上清を1.5インチの磁気攪拌棒を含む滅菌60ミリリットルの瓶に慎重にデカントし、ペトリ皿を追加の収穫培地ですすいで残りの表皮細胞を収集します。

瓶内の最終容量を新鮮な培地で30ミリリットルにし、表皮細胞溶液を室温で毎分100回転で20分間攪拌します