ケラチノサイトコロニー形成アッセイ:ケラチノサイトのコロニー成長能力を評価するためのIn Vitroアッセイ

- コロニー形成アッセイは、個々の細胞が増殖してコロニーを形成する能力を決定します。まず、培養プレートでマウス背側の皮膚を切除します。皮膚の腹側から皮下組織と脂肪をこすり落とします。組織を消化液で処理します。溶液中のタンパク質分解酵素は細胞外マトリックスを分解し、表皮細胞の解離を誘導します。

表皮層をそっとこすり落とし、解離した細胞と毛を採取培地に放出します。適切なストレーナーで懸濁液をろ過し、毛や破片を捕捉し、表皮細胞の単一細胞懸濁液を取得します。この細胞懸濁液の所望の量を、増殖停止フィーダー細胞の接着層を含むコラーゲンコーティングプレートに移します。ケラチノサイトの生存を促進する適切な培地を補充します。

培養中、ケラチノサイトはフィーダー層に付着します。さらに、これらのフィーダー細胞は成長因子を分泌し、ケラチノサイトの成長をサポートする細胞外マトリックスタンパク質を合成します。個々のケラチノサイトの増殖能力に応じて、それらはコロニーを形成し始めます。メディアを取り外し、コロニーを修理します。適切な色素で細胞を染色し、コロニーを検出してカウントします。次のプロトコルでは、試験化合物による処理後に成体マウスから採取した初代ケラチノサイトのクローン形成アッセイを実施します。

- 安楽死させた成体マウスから背側皮膚サンプルを採取した後、オートクレーブ滅菌した鉗子とメスを使用して、一度に1つの背側皮膚を毛むくじゃらを下にして薄いシャーレに入れ、皮下組織を削り取ります、皮膚組織の腹側から脂肪を含む皮下組織を、組織が半透明になるまで。

この削り取ったスキンを、他のすべての残りのスキンが処理されるまでPBSに入れます。次に、メスを使用して、皮膚サンプルを0.5 x 1〜1.5センチメートルのストリップにスライスします。サンプルを上向きにして滅菌ペトリ皿にストリップの毛むくじゃらの面を上に置き、サンプルを毛むくじゃらにして、プラスチックの100×20ミリメートルのペトリ皿に0.25%トリプシンを添加した2xゲンタマイシン溶液の表面に浮かべます32°Cで2時間。

インキュベーションの終わりに、15ミリリットルの収穫培地が入った滅菌プラスチック製の正方形のペトリ皿を30度の傾斜に置き、湾曲した鉗子を使用して浮遊する皮膚ストリップを慎重に皿に移します。新しいメスの刃を皮膚に対して垂直な角度で保持し、十分な力を使用しますが、過度の力を加えずに、サンプルの表皮と毛をこすり落とします。

すべてのストリップがこすり落とされたら、表皮細胞を含む上清を1.5インチの磁気攪拌棒を含む滅菌60ミリリットルの瓶に慎重にデカントし、ペトリ皿を追加の収穫培地ですすいで残りの表皮細胞を収集します。

瓶内の最終容量を新鮮な培地で30ミリリットルにし、表皮細胞溶液を室温で毎分100回転で20分間攪拌します。攪拌インキュベーションの終了時に、バイオセーフティキャビネット内で攪拌子を取り外し、70マイクロメートルのストレーナーを介して細胞溶液をろ過し、50ミリリットルの円錐管に入れます。

鉗子を使用して、ストレーナーを介して毛と角質層の材料を押し、組織を操作して閉じ込められた有毛細胞を解放し、さらに5ミリリットルの収穫媒体を使用して、残りの閉じ込められた有毛細胞をチューブに放出します。

- 表皮細胞と毛髪を操作して、毛包から細胞を放出することが重要です。

- チューブ内の総容量を新鮮な培地で最大50ミリリットルにし、遠心分離によって細胞濾液を回収します。ペレットを5ミリリットルの新鮮な収穫培地に再懸濁し、5ミリリットルのピペットで約20回のトリチュレーションを行います。0.5:1希釈液の20ミリリットルを取り、2ミリリットルのマイクロチューブに移します。

サンプルを慎重に混合した後、マイクロチューブから200マイクロリットルを取り出し、等量の0.4%トリパンブルー溶液と穏やかに混合します。この溶液を3回穏やかに混合し、細胞を血球計算盤に移して有核ケラチノサイトをカウントします。

すべての濃い青色の細胞を非生存細胞としてスコアリングし、小さな金色のピンクがかった細胞を生存細胞としてスコアリングします。生存率は平均で約80%で、マウス1匹あたりの最終的なケラチノサイト収量は約3,000万個の生存細胞であるべきです。計数後、再度遠心分離して細胞を回収し、大量培養のために、2ミリリットルの細胞培養培地に35mmペトリ皿あたり10〜6番目の生細胞であるケラチノサイトを2〜4回再懸濁します。

クローン形成アッセイのために、X線照射したスイスマウス3T3フィーダー層に、コラーゲン被覆60ミリメートルペトリ皿あたりのサプリメントおよび血清濃度を含む改変ウィリアムズE培地の4ミリリットルあたり3番目のケラチノサイトに細胞を1×10で再懸濁します。

大量培養の場合は、5%の二酸化炭素で摂氏32度で適切な細胞培養期間で培養し、最初の播種から24時間後に培地を交換して大量培養し、その後は週に3回、

クローン培養の最後に、培地を吸引し、コロニーを10%緩衝ホルマリンに室温で一晩固定します。翌朝、0.5%ローダミンBをオートクレーブ水で1時間染色した後、水が透明になるまで冷たいオートクレーブ水で皿をすすぎます。次に、コロニーを数える前に、蓋の上の皿を傾けて乾