miniCoopRベクターベーストランスジェネシス:ゼブラフィッシュ腫瘍モデルにおける黒色腫誘導遺伝子をスクリーニングする技術

- ゼブラフィッシュでは、メラノーマはメラノサイト(メラニン産生細胞)の悪性形質転換から生じます。黒色腫の発症を研究するには、黒色腫になりやすいメラノサイト欠損トランスジェニックゼブラフィッシュモデルを使用します。このモデルは、メラノサイト特異的なmitfaプロモーターの機能喪失型変異により、メラノサイトを欠

まず、このトランスジェニックモデルの単細胞胚を寒天プレート上で採取します。トランスポゾンベースのminiCoopRベクターとトランスポゼース酵素mRNAを含む混合物を胚に同時注入します。このベクターには、2つのトランスポゾン要素の間に挟まれた候補遺伝子に結合したプロモーターを運ぶmitfa minigeneを含む遺伝子カセットが含まれています。

同時注入されたmRNAは、トランスポゼースタンパク質をコードします。これらのタンパク質はトランスポゾンエレメントに作用し、miniCoopRベクターからのカセット切除を触媒し、続いて胚のゲノムDNAに組み込みます。その後、カセットプロモーターは、mitfa遺伝子と目的の候補遺伝子の両方の発現を駆動します。

mitfa遺伝子はメラノサイトの救助と発生をサポートし、候補遺伝子は発がん性の場合、メラノーマの発症を誘発します。現像したゼブラフィッシュをスクリーニングします。救助されたメラノサイトを持つトランスジェニックフィッシュはメラニン色素を発症し、メラノーマを持つ魚は隆起した色素性病変を運びます。

次のプロトコルでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ腫瘍モデルにおけるminiCoopRベクターを使用したメラノーマ発症修飾因子のスクリーニングを示します。

- 注射用のコンストラクトを生成するには、目的の遺伝子の完全長オープンリーディングフレームをPCR増幅し、pDONR221に再結合することにより、Gatewayミドルエントリークローンを作成することから始めます。次に、Multisite Gatewayテクノロジーを使用して、メラノサイト特異的mitfaプロモーター、目的遺伝子、およびポリアデニル化シグナルをminiCoopRベクターに再結合し、目的遺伝子をmitfaプロモーターの制御下に置きます。

各クローンの25ピコグラムと25ピコグラムのTol2トランスポゼースmRNAを、1細胞、トランスジェニック、トリプルホモ接合ゼブラフィッシュの胚に注入します。mitfa-BRAF-p53変異体はメラノサイトが欠損しており、形質転換やメラノーマ形成を起こしやすいです。目的の遺伝子とともに、miniCoopRベクターにはレスキューmitfa minigeneが含まれています。したがって、注射に成功した動物は、目的の遺伝子を発現する救助されたメラノサイトを開発します。

注入した胚を摂氏28.5度でインキュベートします。受精後24時間(hpf)で、死んだ胚をすべて取り除きます。受精後72時間で、白い背景に入射光の下で解剖顕微鏡を使用して、救助されたメラノサイトを持つトランスジェニック動物を選択します。

動物が受精後4日に達したら、ゼブラフィッシュ施設の苗床にある3リットルのタンクに移します。生後2か月で、メラノサイトのレスキュー領域が4ミリメートル四方を超える少なくとも1つの領域を持つ動物を選択します。選択した動物を腫瘍の存在について毎週スクリーニングします。研究のために腫瘍発生動物を分離します。

横軸の年齢と週数、縦軸の黒色腫のない生存率の黒色腫のない生存曲線を描きます。目的遺伝子を発現するメラノサイトと比較し、メラノサイトでEGFPを発現する動物を制御します。ログランク検定を使用して、2つの曲線が統計的に異なるかどうかを判断します。