0 閲覧数 • 3:45 分 • April 30th, 2023
- 転写因子は、DNA結合ドメインを含むタンパク質です。それらは特定のDNA配列に結合し、細胞内の遺伝子発現を調節するのを助けます。鱗片関連メラノサイトにおける転写因子の発現を検出するには、まず、麻酔をかけたゼブラフィッシュから暗い色素沈着した背側鱗を採取します。スケールを固定し、透過化溶液で処理して、個々のメラノサイトを透過性にします。
漂白剤溶液で処理して、細胞から暗いメラニン色素の顆粒を取り除きます。この漂白プロセスにより、その後の染色ステップで顔料に関連するバックグラウンドシグナルが発生する可能性がなくなります。タンパク質を含むブロッキング溶液とインキュベートして、細胞表面上の非特異的タンパク質結合部位をブロックします。
次に、サンプルを目的の一次抗体で処理します。これらの抗体は、細胞内の標的転写因子に結合します。次に、一次抗体に特異的な蛍光タグ付き二次抗体でサンプルを標識します。さらに、適切な蛍光DNA結合色素でサンプルを処理して、細胞核を染色します。蛍光顕微鏡を使用して、転写因子-抗体複合体および細胞核からの明るい蛍光発光を検出します。
次のプロトコールでは、トランスジェニックゼブラフィッシュにおけるメラノサイト誘導転写因子A(mitfa)を発現する背側鱗結合メラノサイトの免疫染色を示します。
- 免疫染色を行うには、トリカイン1ミリリットルあたり0.17ミリグラムで魚を麻酔します。解剖顕微鏡で入射光を当て、鋭利な先端の細い鉗子を使用して背側の鱗を摘み取り、メラノサイトを含む鱗の半分を傷つけないように注意してください。鉗子から直接スケールを1ミリリットルの固定液に入れ、回転させながら室温で2時間以上インキュベートします。魚を魚の水に移し、魚を監視して回復が成功したことを確認します。
色素性メラノサイトを漂白するには、まず、PBSTで固定スケールを室温で5分間2回洗浄します。次に、作りたての漂白剤溶液1ミリリットルを加え、パラフィルムまたはキャップロックで覆い、ガスがチューブが破裂するのを防ぎます。顔料がなくなるまで漂白を続けます。その後、PBSTで室温で5分間4回洗浄します。
ブロック溶液中で少なくとも30分間インキュベートします。次に、約400 μLの一次抗体とブロック溶液中で室温で一晩インキュベートします。翌日、スケールをPBSTで室温で30分間3回洗浄します。二次抗体と室温で2時間から一晩インキュベートします。
DAPIで染色した後、スライドガラスにベクタシールドを一滴垂らし、スケールの凹面がスライドに対して下を向くようにスケールを取り付けます。サンプルの上にガラスカバースリップを置きます。透明なマニキュアを使用してエッジをシールし、蛍光顕微鏡でスライドを観察します。