皮下移植アッセイ:ドナーからレシピエントゼブラフィッシュモデルへのメラノーマ細胞移植法

- 黒色腫移植アッセイでは、腫瘍発生を研究するために、腫瘍担存ゼブラフィッシュのがん細胞を免疫不全レシピエントモデルに移植します。まず、安楽死させた腫瘍担体ドナーゼブラフィッシュを採取し、その体から腫瘍を外科的に切除します。腫瘍を適切な緩衝液を含むシャーレに移し、細かく刻みます。

次に、ピペットを使用して腫瘍断片を粉砕します。これにより、腫瘍片が個々の細胞に解離します。次に、腫瘍細胞懸濁液をシリンジにロードします。その後、免疫不全のレシピエントであるキャスパーゼブラフィッシュを濾紙に調製します。この色素沈着欠損のゼブラフィッシュの変異体は、メラノサイトと虹彩胞を欠いているため、イメージングや移植実験に透明で汎用性があります。

次に、キャスパーゼブラフィッシュの後脳と背びれの中間にある腹腔の上の領域に、プリロードされた黒色腫細胞懸濁液を皮下注射します。次に、レシピエントの魚を水中に移し、腫瘍の発生を観察するために監視します。ゼブラフィッシュの透明な体は、発生した腫瘍を簡単に視覚化するのに役立ちます。

次のプロトコルでは、トランスジェニック腫瘍担存ゼブラフィッシュドナーから免疫不全レシピエントキャスパーフィッシュモデルへのメラノーマ細胞の移植を示します。

- 移植の1日前に、生後2〜3か月のキャスパー魚に25Gyのガンマ線を照射した後、魚が魚水中で回復するのを待ちます。トリカインを使用して、腫瘍を持つ魚を安楽死させます。腫瘍を切り取り、約5ミリリットルのフィルターで0.9x PBSを5%FPSで滅菌したシャーレに入れます。かみそりを使用して、溶液中に腫瘍をさいの目に切ります。

室温でP1000ピペットを使用して作業し、トリーツレートして単一細胞を作製します。容量を25ミリリットルに上げます。40 μmメッシュフィルターで溶液をろ過し、卓上遠心分離機で453 rcfで10分間遠心します。ペレットを0.9%PBS、5%FBSに所望の濃度に再懸濁します。

血球計算盤を使用して、正確な細胞数を計算し、最終注入量が約5マイクロリットルになるように細胞懸濁液を希釈します。例えば、50,000個の細胞を注入する場合、細胞懸濁液を1マイクロリットルあたり10,000個の細胞の最終濃度に希釈する必要があります。細胞懸濁液の入ったチューブを数分おきにフリックして、細胞の凝集を防ぎます。

100%エタノールと0.9x PBSを使用して、26sゲージ(ベベルチップ)701 N 10マイクロリットルのハミルトンシリンジを2〜3回洗浄してから、シリンジに5マイクロリットルの細胞懸濁液をロードします。照射されたレシピエントフィッシュをトリカインで麻酔した後、湿らせたキムワイプに横向きに置きます。

片手で魚を安定させ、斜角を上にして針を腹腔の上の魚の側面に45度の角度で挿入します。後脳の後方境界と背びれの内側境界のほぼ中間あたりです。プランジャーを軽く押し下げます。魚が新鮮な魚の水で回復するのを許し、腫瘍の生着のために毎日魚を観察します。生着が起こった場合、継続的な成長と病気の発症も観察できます。