で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム

次の実験の全体的な目標は、再現性と定量化可能な結果を生成するのに十分な厳密さを備えた安価なタイムラプスマイクロシネマトグラフィーアッセイを開発することです。これは、安価な再利用可能なシリコンガスケットを使用して、アグロスメディアプレートまたは顕微鏡スライドを構築することによって達成されます。これらのプレート複合体が、さまざまな培地タイプおよび寒天濃度にわたって1週間以上水和し、十分に酸素化されたままであることを示す結果が得られました。

さらに、タイムラプスマイクロシネマトグラフィーは時間のかかるプロセスであるため、8つの安価な顕微鏡を使用することで、データ取得を加速できます。こんにちは、シラキュース大学生物学部のロイ・ウェルチ博士研究室のライアン・テイラーです。今日は、私たちの研究室で細菌のバイオフィルムのタイムラプス動画を作成する手順をお見せします。この手順を使用して、MTIのバイオフィルムの多細胞挙動を研究します。

それでは始めましょう。この手順を開始するには、一晩混合したOccus sanus培養物とクラットメーターの細胞密度を測定し、培養物の1ミリリットルを2.5ミリリットルの遠心分離チューブペレット洗浄に移し、添付の書面によるプロトコル、ピペットおよびボルテックスに記載されているようにTPM培地に細菌を再懸濁してペレットを完全に再懸濁しますが、これには時間がかかる場合があります。次に、アッセイ培地であるTPM50ミリリットルに0.5グラムのarosを加えます。

また、50ミリリットルのC-T-T-Y-Eに0.5グラムのarosを加えます。これは、滅菌するための栄養ディスクメディアオートクレーブです。次に、培地をインキュベーターまたはウォーターバスで摂氏55度に維持します。トラッキングアッセイの構築中。

プレート複合体は、栄養ディスクの最初の火炎滅菌器ガラス顕微鏡を構築するために進行します。スライドさせて、厚さ0.5mmの滅菌シリコンゴムガスケットをスライドの上に置きます。約300マイクロリットルのC TT YE培地をピペットで、スライド上のガスケットによって作られたウェルに送り込みます。

C-T-T-Y-Eメディアアグロは、炎を盛り上げ、別のスライドを滅菌し、CTYEメディアアロの上に斜めに置く必要があります。スライドを斜めに下げることで、気泡の発生を防ぎます。スライドが所定の位置に配置されたら、両側に1つずつミニバインダークリップを使用して複合体をふっくらさせます。

クリップしたコンプレックスを摂氏4度に置き、CTY-Eメディアアグロをセットします。通常、これには約 5 分かかります。アグロをセットすると、トラッキングアッセイで使用するプレート複合体を調製できます。

まず、アッセイ複合体を構築するためのスライドを準備します。各複雑な炎に対して、2つのガラス顕微鏡スライドを滅菌しました。スライドの1つの上にオートクレーブガスケットを置き、アッセイの底部を形成します。

もう一方のスライドは、アグロスを平らにするため、およびサポートスライドとして使用されます。アッセイの上部はカバースリップです。まず、顕微鏡スライドをラベリングテープで包み、次に火炎滅菌器のガラスカバースリップを包み、滅菌したラップスライドの上に置きます。

ラップされたスライドを上にスライドさせてカバースリップを支え、ひび割れを防ぎます。鉗子で炎滅菌されたカバースリップの上にオートクレーブガスケットを置きます。下部スライドのガスケットを押し下げると、カバーが滑り落ちて、ガラスとシールが形成されていることを確認します。

そうしないと、アレイのメディアが乾燥する可能性があります。スライドガスケットとカバースリップガスケットアセンブリを脇に置き、滅菌面を上にして、今後は一度に1つの複合体でのみ作業することで、メディアアグロスが固化して映画の品質が悪くなるのを防ぎます。栄養ディスクを置くことから始めます。

栄養ディスク複合体を摂氏4度から取り出します。バインドエクリプスと前の部分を取り外し、100マイクロリットルのガラス使い捨てチップを備えたマイクロサンプリングピペットを使用して、固化したCTY-Eアロスを露出させたスライドを取り外してください。C-T-T-Y-Eメディアアグロから直径1mmの栄養ディスクも取り外し、カバースリップのガスケットによって作成されたウェルに入れます。

次に、インキュベーターからTPM培地グロスを取り出し、カバースリップのガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むウェルに300マイクロリットルをピペットで移します。TPMメディアAgrosは、T-P-M-S-Aミディアムアロスを平らにするためにマウンドアップする必要があります ガスケットなしで火炎滅菌スライドの1つをTPMメディアアロスの上に斜めに置きます。スライドを斜めに配置すると、気泡の発生を防ぐことができます。

ミニバインダークリップで複合体を両側に1つずつクランプします。クリップしたコンプレックスを摂氏4度に置き、メディアが発生したのをセットします。通常、これには約 5 分かかります。

メディアがセットされたら、摂氏4度から複合体を取り外します。バインダークリップを取り外し、複合体の端を絞ります。テープで巻かれたスライドを緩めるには、テープで巻かれたスライドを取り外し、ベンチに置いてさらに使用します。

次に、一対の鉗子をくさびとして使用します。カバースリップガスケットメディアアグロスコンプレックスをサポートスライドから分離し、サポートスライドを廃棄します。カバースリップガスケットコンプレックスを分離するためにこじ開け動作を使用しないでください。これにより、カバースリップブレーキがかかったり、メディアアレイがサポートスライドに付着したりする可能性があるためです。

サポートスライドを取り外した後、ガスケット面を上にして、カバースリップガスケットメディアアレイコンプレックスをテープラップスライドに置きます。この複合体をバーナーの隣に置き、新しく露出したメディアグロス表面から目に見えるすべての水分が蒸発するのを待ちます。培地を1分以上乾燥させないでください。

これはM Zantの群れの挙動に影響を与える可能性があるため、新たに調製したアッセイ複合体に細胞を播種します。カバースリップガスケット媒体から余分な水分が蒸発したら、アグロスコンプレックスは、濃縮されたセルの0.5マイクロリットルを吸引して媒体に堆積させます。エアロスは、メディアアグロスに近づく前にピペットの先端を押し下げます。

ピペットチップの底に細胞の滴が現れるため、チップが培地に触れることなく細胞を沈着させやすくなります。アグロス表面のくぼみは、群れのmzの行動を変える可能性があります。ピペットをまっすぐ下に動かして、埋め込まれた栄養ディスクから約1mm離れた場所で細胞を分注します。

次に、ピペットをまっすぐ引き上げます。このようにして、群れが円形であることが保証されます。セルが堆積したら、複合体をバーナーの隣に置き、セルが20秒以内にスポット乾燥するのを待ちます。

乾燥後、コンプレックスの底部を形成するスライドガスケットアセンブリをカバーのガスケットに合わせます。スリップガスケット媒体アクロセル複合体は、複合体の上部を形成します。軽く押してシールを形成します。

カバースリップ内のスライドの表面をキムワイプで清掃し、残留物を取り除き、結露を防ぎます。スライドを下にしてカバーを上にしてスライドを洗浄した直後に、コンプレックスを加熱された顕微鏡ステージに置きます。結露が発生した場合は、スライドコンプレックスを加熱ステージに数秒間置いてから、画像取得ソフトウェアを起動します。

動画を準備するには、顕微鏡で2 x 4 xまたは10 xの適切な対物レンズを選択します。カメラと顕微鏡の電源を入れ、光のレベルをチェックして、光が強すぎないことを確認します。コンピュータを起動し、画像取得プログラムを開きます。

ライブ画像ウィンドウをクリックし、顕微鏡の焦点を合わせます。画像はここに示すようなもので表示されます。画像の取得を開始します。

最初の1時間は、メディア寒天が落ち着き、ピントがずれる傾向があるため、定期的にピントを確認してください。画像の取得が完了したら、取得した画像を転送して保存します。スライドコンプレックスを90%エタノールに一晩浸すか、ガスケットをTOLAして再利用して

このタイムラプス動画は、ここで説明するトラッキングアッセイを受けた様子を示しています。キャプチャレートは倍率20倍で1分間に1画像、再生レートは毎秒60画像です。このタイムラプス動画は、細胞の1%がGFPを発現している細胞の集団を示しています。

この映画は、交互の位相差と蛍光画像をマージして編集されました。アッセイは、1%Arosの捕捉率は100倍×の倍率として1分あたり1枚の画像である1%でC-T-T-Y-Eで行われた。このタイムラプス動画は、M Anthesの滑空運動性を示しています。

このアッセイは、C-T-T-Y-Eに対して、100 xの倍率で1分間に1枚の画像であるArosのキャプチャレートで実施されました。このタイムラプス動画は、P OSAのけいれん運動を示しています。このアッセイは、1%Arosの捕捉率でLBに対して1分間に1つの画像で実施されました。

倍率20倍で、再生速度は毎秒60枚です。このタイムラプス動画は、スマールが群がる運動性を感じていることを示しています。このアッセイはLBで実施され、1%Arisの捕捉率は1分間に1枚の画像です。

倍率20倍で、再生速度は毎秒60枚です。このタイムラプス動画は、EGTの滑り運動性を示しています。このアッセイは、0.5%でLBで実施されましたtagローズキャプチャレートは、20倍再生速度の倍率が1秒あたり120画像であるため、1分間に1画像です。

このアッセイでは、図1のBに見られる大きなガスケットを使用しています。細菌のバイオフィルムのタイムラプス動画を生成する方法を紹介しました。この手順を実行する場合。一貫した結果を得るためには、時間をかけてできるだけ正確に行うことが重要です。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。