Name: で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-06T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ Myxococcus xanthus の多細胞行動をタイムラプス顕微撮影で観察する方法。シリコーンガスケットを用いて低コストで再現性のある細菌群集遊走の定量化を実現し、微生物学の研究に活用できます。

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この研究は、RDWの国立科学財団のキャリア賞（MCB - 0746066、創発行動を規制する転写活性化因子の特性）によって可能となった私たちは、原稿上で有用な議論やコメントのためのLJシムカス、BSゴールドマン、G.孫、M.歌手、LGウェルチ、KAマーフィー、およびHGテイラーに感謝しています。

消耗品は必要なもの： <ul><li>クレットメートル</li><li>ピペットとヒント</li><li> 2.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ</li><li>マイクロ遠心機</li><li> CTTYEメディア： <ul><li> 1.0％Casitone（ディフコ社）、0.5％酵母エキス（ディフコ社）、 </li><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li> TPMメディア： <ul><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li>アガロース</li><li> 55 ° Cに設定したウォーターバス</li><li>顕微鏡用スライドガラス</li><li>大きなガラス製カバースリップ</li><li> 2 × 2センチ、0.5 mm厚のシリコーンゴムガスケット（グレースバイオラボ社） </li><li>パラフィルム（またはテープにラベルを付ける） </li><li>鉗子</li><li>小さなバインダークリップ</li><li>マイクロサンプリングピペット（フィッシャー） </li><li> 100μlのガラスディスポチップ（フィッシャー） </li><li>キムワイプ</li></ul>パート1：セルの準備無菌環境を作成することから始めます。 <ul><li>クリーンワークスペース、ドン手袋、および光バーナー。 </li></ul><ol><li> CTTYEブロスを含むフラスコに接種し、精力的な渦巻きで32℃の暗所でインキュベートして細胞の一晩培養を開始します。 </li><li>かつての文化は、2.5 mlマイクロチューブに5 × 10 8細胞/ ml、ピペット1mlの細胞の密度に達した。 </li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットルTPM（塩バランス、栄養培地）で細胞ペレットを洗浄する。 <ul><li>再サスペンドと渦</li></ul></li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間回転させて再細胞をペレット化。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 重要なステップ </li><li>完全にピペッティングし、ボルテックスの組み合わせを使用して100μlのTPMのメディアでペレットを再懸濁する。 重要：このステップでは、チューブに残っている細胞のない塊がないことを保証します。これには時間がかかることがあります。 </li><li>追跡アッセイプレートを準備しながら、室温で脇にセルを設定します。 </li></ol>パート2：寒天の準備<ol><li> TPM（アッセイ培地）とCTTYE（栄養ディスク）メディアの両方を50mlを準備します。 </li><li>各（アガロースは寒天より小さい回折である）で0.5 Gアガロースを追加。 </li><li>滅菌にオートクレーブ。 </li><li>追跡アッセイプレートの複合体を構築しながら滅菌した後、55℃インキュベーターでC（または水浴）でメディアを維持する。 </li></ol>パート3：ニュートリティブディスクの構築<ol><li>小さなウェルを形成、火炎滅菌したガラスの顕微鏡スライドの上に滅菌した0.5 mm厚のシリコーンゴムのガスケットを置きます。 </li><li>ピペットでよく、スライド上のガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃CTTYEメディア/アガロースを300μl。 CTTYEメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 </li><li> CTTYEメディア/アガロースの上に火炎滅菌スライドを（なしガスケット付き）に置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドが配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4℃をクリップコンプレックスを置き、CTTYEメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>パート4：追跡アッセイの準備 - プレート錯体を設定 、コンポーネントを組み立てるスライドの複合体を準備し、栄養ディスクを置き、TPMメディア/アガロースを注ぎ、別と乾板の複合体、プレートの細胞を、そして追跡アッセイプレートの複合体を組み立てる。 プレート複雑なコンポーネントを組み立てる<ol><li>それぞれ複雑なため、炎がガラスの顕微鏡スライドを滅菌</li><li>スライドの上にオートクレーブガスケットを配置して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アッセイの底部を形成することになる。 </li><li>炎は、ガラスのカバースリップを滅菌し、第2のガラス顕微鏡スライドラベルテープ（またはパラフィルム）で包み、（側を上に滅菌）取っておくの上に置きます。これは、クラッキングからカバースリップを保つためにサポートのスライドとして使用されます。これは、アッセイの上部を形成することになる。 </li><li>炎はサードガラスの顕微鏡スライドを滅菌して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アガロースを平らにするために使用されます。 重要：ガスケットは、鉗子でそれを押すことで、ガラスとのシールを形成することを確認し、そうでなければメディア/アガロースが完全に乾くことがあります。 </li></ol> P栄養ディスクをレース重要：手順5〜10は、一度に複雑な1枚のスライドに行う必要があります、それ以外のメディア/アガロースは悪いムービーの画質が得固化し始めることができます。 <ol start="5"><li>栄養ディスク複雑なフォームを削除4 ° C（パート3からステップ5）と、今固化CTTYE /アガロースを公開するスライドを離れてテコで。 </li><li>よく100μlのガラス使い捨てチップとマイクロサンプリングピペットを用いて、上記CTTYEメディア/アガロースから直径1mm"栄養ディスク'を削除してもカバースリップ（上記手順3）でガスケットによって作成されたに入れてください。 </li></ol>プレートに注ぎ 重要なステップ <ol start="7"><li>ピペットでよくカバースリップでガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃TPMメディア/アガロースを300μl。 TPMメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 重要なステップ </li><li> TPMメディア/アガロースの上にないガスケット（ステップ3から）を持つ火炎滅菌スライドを置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドは、（ステップ5から）配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4で切り取られた複雑なを置き° Cとメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>独立したと乾板重要：乾燥からメディア/アガロースを防ぐために、〜20手順11は、一度に一つのスライドの複雑で実行する必要があります。 重要：最良の結果を得るには、11〜13を工程は4で実施されるべき℃の<ol start="11"><li>メディア/アガロース設定した後、バインダークリップを削除し、テープでラップされたスライドを緩めるために複雑なの終わりを絞る。 </li><li>テープラップされたスライドを削除し、後で使用できるようにベンチの上に置きます。 重要なステップ</li><li>ウェッジとして鉗子を使用して、サポートのスライド（なしガスケット付き）からカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体を分離し、サポートのスライドを捨てる。 重要：カバースリップ/ガスケット複合体を分離するために詮索好きなモーションを使用しないでください。これにより、カバーガラスの破壊及び/またはメディア/アガロース支持のスライドに付着する可能性があります。 </li><li>テープによって包まれたスライドにカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体（ガスケットのある面を上に）配置し、4から削除℃まで以上より1分 - すべて目に見える水分が新たに露出したメディア/アガロース表面から蒸発できるように、バーナーへのこの複雑な横に置きます。 重要：これはM.に影響を与える可能性があるとして長すぎるためにメディア/アガロース乾燥をさせてくださいザンザス群れ行動。 </li></ol>プレートの細胞重要なステップ<ol><li>一度、余分な水分は、離れて栄養ディスクからメディア/アガロース約1mm上に濃縮された細胞（パート1から手順8）のピペット0.5μlを蒸発している。 重要：細胞がまっすぐにまっすぐ下にしてからピペットを移動することによって堆積されていることを確認することが極めて重要です。これは群れが円形になることが保証されます。 重要：これは、メディア/アガロースにピペットの先端に触れないように非常に重要です。これは、表面にうつ病を行い、M.の動作を変更しますザンザス群れ。 ヒント：メディア/アガロースに近づいて前にピペットチップを押圧し。これは、セルのドロップがピペットの先端の下部に表示されるとそれが簡単に細胞を付着させるようにすることができます。 </li><li>一度細胞が堆積され、細胞のスポットを乾燥させるためにバーナーへの複雑な次を配置 - は20を超える秒。 </li></ol>アッセイを組み立てる<ol><li>セルのスポットが乾燥した後、カバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース/細胞複合体（ステップ13から）上のガスケットとスライド/ガスケットの複合体を（ステップ1から）に合わせ、ゆっくりと軸シールを形成するために一緒に押します。 重要なステップ</li><li>スライドの表面を清掃し、パラフィルムで残留物を除去するためにキムワイプでスリップをカバー。完成したアッセイは、図1のようになります。 </li><li>すぐに結露のフォームを防止するために（ステップ15）ワイプの後に32 ° C（スライドダウン、アップスリップカバー）に維持加熱ステージ上で複雑な完成したスライドを置きます。結露が形成されている場合は、複雑なスライドが画像集録ソフトウェアを起動する前に数秒間加熱ステージの上に座ってみましょう。 </li><li>適切な目標を（、2X 4X、または10倍）を選択します。 </li></ol>パート5：ムービーの準備T"&gt;重要なステップ<ol><li>カメラと顕微鏡の電源をオンにして、（光が強すぎるではないことを確認してください）​​光のレベルを確認してください。コンピュータを起動し、画像取得プログラムを開きます。 </li><li>ライブ画像のウィンドウをクリックして、顕微鏡の焦点を合わせる。画像は、図3に見られるもののように表示されるはずです。均一な寒天の表面に注目してください。 </li><li>画像を取得開始します。 重要なステップ</li><li>メディア/寒天がドリフトにフォーカスを引き起こして解決する傾向があるので、1時間の間、定期的にフォーカスを確認してください。 </li><li>作業領域をきれいに。 </li><li>画像の取り込みが完了すると、転送はストレージ用の画像を取得し、一晩90％エタノールに浸漬することによってスライド複合体を分解する。 </li><li>再利用のためにオートクレーブガスケット。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。TMプレートの複雑なの漫画イラスト。 （A）分解図と​​断面図の基本的なTMのプレートコンプレックスを示しています。 （B）より大きいガスケットの使用方法を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2顕微鏡のクラスタ。各顕微鏡のノードは、（挿入図）ニコンE400顕微鏡、目標、加熱ステージ、インサイトのカメラ、およびノー​​トブックコンピュータで構成されています。各ノードが相互にネットワーク接続し、マスタコントローラのコンピュータにリンクされています。ノードの二つは、EXFO光源二Uniblitzのシャッターで構成される蛍光の機能を使用して設定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。追跡アッセイ装置の20倍の画像を一度に= 0。スケールバーは1mm。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。TMプレートの複合体の適応性。 M.の（A）100Xの画像1.0％寒天でCTTYE上ザンザス滑走運動。 Pの（B）20Xの画像緑膿菌は運動性をけいれん。 （C）20X画像S.マルセッセンスでは、運動性を分封。両方（B）と（C）は1.0％の寒天のLBで検定した。 M.の（D）40 ×画像スメグマチスは、0.5％寒天のLBで運動をスライディング。この画像は、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して捕獲した。 ビデオ1。追跡アッセイに供群れのタイムラプスビデオ。 M.のビデオ2。タイムラプスビデオ細胞の1％が蛍光標識されているザンザス群れ。交互位相コントラストおよび蛍光画像がキャプチャされ、群れの中で蛍光細胞の位置を明らかにするために重ねていた。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 M.のビデオ3。タイムラプスビデオザンザス滑走運動。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 P.のビデオは、4。タイムラプスビデオ緑膿菌は運動性をけいれん。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ5。S.のタイムラプスビデオマルセッセンスでは、運動性を分封。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ6。M.のタイムラプスビデオチスは運動性をスライディング。このビデオは、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して、0.5％寒天のLBでキャプチャされました。

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<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li>
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<li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li>
<li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li>
<li>Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

タイムラプスmicrocinematography（TM）は、原核生物の運動性2-7を研究するための一般的な手法となっています。伝統的に、TMは、基板8から11のようにろ紙の芯、薄い寒天パッド、または寒天のスラブを使用して実行されます。細菌の運動の一般的なイラストのためのイメージシーケンスを生成するために使用するときにこれらのメソッドは効果が十分とコストです。しかし、イメージシーケンスの再現性と定量的に厳密なデータが生成される必要がある場合は、これらの方法は時間がかかり、やや信頼性に欠けます。例えば、ヒューマンエラーによって引き起こされるこれらの技術の変化は、劇的に測定基板の一方の側から焦点面の違いに研究されている細菌の挙動に影響を与える可能性の寒天表面の不規則性から、不正確な記述の広い配列につながる可能性があります他に。これらの問題を解決するために、我々は、（図1）の両方安価および再利用が可能なシリコンガスケットを採用することにより、再現性のある結果を得るために十分に一貫した品質であるTMプレート複合体を設計しました。さらに、プレートの複合体が高度に変更可能であり、メディアタイプと寒天濃度の...

<table><tbody><tr><td>1.0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% 酵母エキス</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロサンプリングピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l ガラス製使い捨てチップ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 cm、厚さ0.5 mmのシリコンゴムガスケット</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

で多細胞の動作を記録する myxococcusザンザス</emタイムラプスmicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

δ-プロテオバクテリアMyxococcusザンザスの群れは、環境の手がかりへの応答として、複雑な、動的なパターンを作成するために一連の信号を通じて、集団的、協調運動として作用する細胞の数百万が含まれています。これらのパターンは、自己組織化と創発であり、それらは個々の細胞の挙動を観察することによって予測することはできません。タイムラプスmicrocinematography追跡アッセイを用いて、我々は、M.の明確な緊急のパターンを同定したザンザスは、そのソース1に向けて栄養勾配まで群れの指示運動として定義されて、走化性と呼ばれる。 効率的にタイムラプスmicrocinematographyを経由して走化性を特徴付けるために、我々は高度に変更可能なプレート複合体を開発した（図1）と8顕微鏡（図2）、キャプチャタイムラプスビデオの各能力のクラスタを構築した。アッセイは、定量データの一貫性のある複製を可能にするのに十分厳格であり、結果のビデオは、私たちは群れの行動の微妙な変化を観察し、追跡することができます。一度キャプチャ、ビデオはビデオの何千もの処理および格納するのに十分なメモリと分析/ストレージコンピュータに転送されます。このセットアップの柔軟性は、M.のいくつかのメンバーに役立っていますザンザスコミュニティ。

勉強する<em&gt; Myxococcusザンザス</em&gt;群れ行動、我々は、異なるアッセイ用に変更することができるタイムラプスmicrocinematographyプロトコルを設計した。それは、顕微鏡に適合した標準的な成長条件を採用し、安価な、再利用可能なシリコンガスケットを使用して再現性のある結果が得られます。我々は、多細胞走化性を定量化するためにこのメソッドを使用している。

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

$\delta$-プロテオバクテリアであるMyxococcus xanthusの群れは、数百万個の細胞を含み、それらが集団として機能し、一連の...を通じて運動を協調させている。

本実験の全体的な目的は、再現可能で定量的な結果を導き出すのに十分な厳密性を備えた、安価なタイムラプス顕微鏡撮影アッセイを開発することです。これは、安価で再利用可能なシリコンガスケットを用いて、アガロース培地プレートまたは顕微鏡スライドを構築することで達成されます。得られた結果から、これらのプレート複合体は、さまざまな培地タイプおよびアガロース濃度において、1週間以上にわたり水分が保持され、十分な酸素供給が維持されることが示されました。さらに、タイムラプス微小映画撮影は時間がかかるプロセスであるため、8台の安価な顕微鏡を使用することでデータ収集を加速させることができます。こんにちは、シラキュース大学生物学部のRoy Welch博士の研究室のRyan Taylorです。本日は、当研究室で行っている細菌バイオフィルムのタイムラプス動画作成の手順について説明します。この手順を用いて、MTIバイオフィルムの多細胞挙動を研究します。それでは開始します。この手順を始めるには、まず、一晩培養したOccus sanusの培養液の細胞密度をセルカウンターで測定します。培養液1 mLを2.5 mL遠心チューブに移し、添付の書面プロトコルに従って、細菌をペレット化し、洗浄してTPM培地で再懸濁します。ピペット操作とボルテックスを行い、ペレットを完全に再懸濁させます。これには時間がかかる場合があります。次に、アッセイ用培地である50 mLのTPMに、0.5 gのarosを添加します。また、0.5 gのarosを50 mLのC-T-T-Y-E（栄養ディスク培地）に加え、オートクレーブで滅菌します。その後、トラッキングアッセイを構築している間、インキュベーターまたはウォーターバスで培地を55 °Cに保持します。プレート複合体の作製にあたり、まず火炎滅菌したガラス顕微鏡スライドを用いて栄養ディスクを構築します。スライドの上に厚さ 0.5 millimeter の滅菌済みシリコンゴムガスケットを配置します。ガスケットによってスライド上に形成されたウェルに、C TT YE 培地を約 300 microliters ピペットで分注します。C-T-T-Y-E培地のシャーレに、火炎滅菌した別のスライドガラスを斜めに載せます。スライドガラスを斜めに置くことで、気泡の形成を防ぐことができます。スライドガラスを配置した後、小型のバインダークリップを両側に1つずつ留めて、複合体を固定します。クリップされた複合体を4 °Cに置き、C-T-T-Y-E培地アガロを凝固させます。通常、これには約5分かかります。アガロが凝固したら、トラッキングアッセイに使用するプレート複合体を調製できます。まず、アッセイ複合体を構築するためのスライドを準備します。複合体ごとに、2枚のガラス製顕微鏡スライドを火炎滅菌します。スライドの1枚の上にオートクレーブ用ガスケットを置き、アッセイの底部を形成します。もう一方のスライドは、アガロスの平坦化および支持スライドとして使用します。アッセイの最上層はカバーガラスとなります。まず、顕微鏡スライドをラベルテープで巻き、次にカバーガラスを火炎滅菌し、滅菌した巻きスライドの上に配置します。カバーガラスを支えるラップされたスライドを上にスライドさせ、カバーガラスが割れないようにします。ピンセットを用いて、火炎滅菌したカバーガラスの上にオートクレーブ用ガスケットを配置します。下のスライドとカバーガラスの両方のガスケットを押し下げ、ガラスとの密閉がなされていることを確認します。そうしないと、培地アレイが乾燥する可能性があります。スライドガスケットとカバーガラスガスケットのアセンブリを、滅菌面を上に向けた状態で脇に置いてください。ここからは、培地アレイの凝固による動画品質の低下を防ぐため、一度に1つの複合体のみを操作してください。まず、栄養ディスクを配置します。4°Cから栄養ディスク複合体を取り出します。バインドエクリプスを取り除き、100 µLのガラス製ディスポーザブルチップを装着したマイクロサンプリングピペットを用いて、凝固したC-T-T-Y-Eアガーを露出させてスライドを準備します。同様に、C-T-T-Y-E培地アガーから直径1 mmの栄養ディスクを切り出し、カバーガラス上のガスケットによって形成されたウェル内に配置します。次に、インキュベーターからTPM培地アガロスを取り出し、カバーガラス上のガスケットによって形成された、栄養ディスクを含むウェルに300 µLをピペットで分注します。TPM培地アガロスを盛り上げて、T-P-M-S-A培地アガロスを平らにします。火炎滅菌したガスケットなしのスライドグラスを、TPM培地アガロスの上の斜めに配置します。スライドグラスを斜めに置くことで、気泡の形成を防ぐことができます。ミニバインダークリップを両側に1つずつ留め、複合体を固定します。クリップで固定した複合体を4 °Cに置き、培地を凝固させます。通常、これには約5分かかります。アガロース培地が固まったら、複合体を4°Cから取り出します。バインダークリップを取り外し、複合体の端を絞ります。テープで巻いたスライドを緩めるため、テープで巻いたスライドを取り出し、後で使用するためにベンチの上に置きます。次に、ピンセットをウェッジ（くさび）として使用し、カバーガラス・ガスケット・メディアアレイ複合体を支持スライドから分離させ、支持スライドを廃棄します。カバーガラス・ガスケット複合体を分離させる際にこじ開けるような動作は行わないでください。カバーガラスの破損や、メディアアレイが支持スライドに固着する原因となる可能性があります。支持スライドを取り除いた後、カバーガラスガスケット培地アレイ複合体を、ガスケット側を上にしてテープを巻いたスライドの上に配置します。この複合体をバーナーの横に置き、新たに露出した培地アグロスの表面から目に見える水分をすべて蒸発させます。培地アグロスを1分以上乾燥させないでください。これはM Zantの群れ行動に影響を及ぼす可能性があるため、新たに調製したアッセイ複合体に細胞を播種してください。カバースリップガスケット培地アグロス複合体から余分な水分が蒸発したら、濃縮細胞を0.5 µL吸引し、培地上に滴下します。培地アグロスに近づく前に、ピペットチップを緩やかに押してください。ピペットチップの先端に細胞の滴が現れるため、チップがメディアアグロスに触れることなく細胞を播種しやすくなります。アグロス表面に凹みができると、スウォームの挙動が変化する可能性があります。ピペットを垂直に下ろし、埋め込まれた栄養ディスクから約1 mm離れた位置に細胞を分注してください。その後、ピペットをまっすぐ上に引き上げます。これにより、群集（スウォーム）が円形になるようにします。細胞を滴下した後、コンプレックスをバーナーの横に置き、細胞スポットを20秒以内に乾燥させます。乾燥後、複合体の底部となるスライドガスケットアセンブリをカバーのガスケットに合わせて配置します。複合体の上部となるガスケットメディアアクロセルコンプレックスを滑り込ませます。軽く押し合わせてシールを形成します。結露を防ぐため、キムワイプでスライドとカバーガラスの表面を拭き、残留物を除去します。スライドを清掃した後、すぐにスライド側を下、カバーガラス側を上にして、加熱ステージの上に複合体を配置します。結露が生じている場合は、画像取得ソフトウェアを起動する前に、複合体を加熱ステージ上に数秒間静置してください。動画を撮影する準備として、顕微鏡の対物レンズから適切な倍率（2倍、4倍、または10倍）を選択します。カメラと顕微鏡の電源を入れ、光が強すぎないことを確認するために光量を調整します。コンピューターを起動し、画像取得プログラムを開きます。ライブイメージウィンドウをクリックし、顕微鏡のフォーカスを合わせます。画像はここに表示されているものと同様になります。画像の取得を開始してください。培地アガロースが沈降して焦点がずれる傾向があるため、最初の1時間は定期的にフォーカスを確認してください。画像取得が完了したら、取得した画像をストレージに転送します。スライド複合体は、90% ethanolに一晩浸して分解させるか、ガスケットをTOLA処理して再利用してください。このタイムラプス動画は、ここで説明したトラッキングアッセイに供されたemを示しています。撮影速度は20倍の倍率で1分間に1枚であり、再生速度は60fpsです。このタイムラプス動画は、細胞の1%がGFPを発現しているeantの細胞集団を示しています。この動画は、位相差像と蛍光像を交互に合成して作成されました。アッセイは1% Arosを含むC-T-T-Y-E中で実施されました。撮影レートは、100倍の倍率で1分間に1枚です。このタイムラプス動画は、M Anthesのグライディング運動を示しています。このアッセイは1% Arosを含むC-T-T-Y-E上で行われました。キャプチャレートは100倍の倍率で1分につき1枚です。このタイムラプス動画はP OSAのtwitching motilityを示しています。このアッセイは1% Arosを含むLB上で行われ、キャプチャレートは1分につき1枚です。20倍の倍速再生において、再生速度は毎秒60フレームです。このタイムラプス動画は、Smar sensesのスウォーミング運動を示しています。このアッセイはLBおよび1%Arisを用いて実施され、キャプチャ速度は1分間に1枚です。20倍の倍率で、再生速度は毎秒60フレームです。このタイムラプス動画はEGTのスライディング運動を示しています。このアッセイは、0.5% Agaroseを含むLB培地で実施されました。キャプチャレートは1分間に1枚であり、0.5% Agaroseの脆弱性のため、20倍の倍率での再生速度は毎秒120フレームとなっています。このアッセイでは、図1 Bに示す大きなガスケットを使用します。ここまで、細菌バイオフィルムのタイムラプス動画の作成方法について説明しました。この手順を行う際は、一貫した結果を得るために、時間をかけ、可能な限り正確に操作することが重要です。以上で終了です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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