Name: ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法によるヒト細胞の動的ヒストン修飾解析。インターフェロンγ誘導によるSTAT1シグナル伝達経路における転写制御メカニズムを定量PCRで評価する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、バージニア大学、バージニア大学がんセンターとトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストによってサポートされています。我々は、細胞株についてはジェームズE.ダーネルラボ（ロックフェラー大学）ロバートロスラボ（フォーダム大学）に感謝します。

プランニング ChIP実験が予定されている日前に、細胞は十分な数が利用できるように、培養すべきである。各ChIPアッセイでは〜1から1.5 × 10 7個の細胞が必要になることを前提としています。常に負（IgG抗体）と正（パンヒストン抗体）のコントロールと重複実験の両方を行う予定です。 ヒント - 2FTGHセルの場合、各ChIPアッセイは、80％コンフルエントで15約一cmの組織培養皿が必要です。 PART 1：クロマチンを調製し、チップのPERFORM <ol><li>培地を取り出し、5 ng / mLのでIFN -γを含有する10％宇宙の子牛血清（CCS）/ DMEM 20mLで必要な時間のために細胞を誘導する。 CCS / DMEMに加え10％の20mLで非誘導プレート上でメディアを交換してください。 </li><li>ドラフトでは、15cmの皿の中でメディアを20mL（1％最終濃度）に540μLの37％ホルムアルデヒドを追加。 ヒント -チルトプレートとメディアプールにホルムアルデヒドを追加-均等にそれを広めるためにしてロックプレート。 </li><li>室温で10分間進行さ架橋を許可する。 </li><li>架橋を停止するには、0.125 Mの最終濃度にグリシンを追加。 </li><li>真空は、培地を吸引除去し、緩衝生理食塩水（PBS）を10mLの氷冷リン酸で細胞を1回洗浄する。 </li><li> 〜7 mLのPBSでセルスクレーパーで細胞を回収し、氷上で50 mLコニカルチューブに同じ処理した細胞を（6プレートから）組み合わせる。 </li><li> 4℃で1800rpmで遠心分離（ベックマンCoutlerアレグラ12 - R遠心）℃で5分間とPBSを吸引除去する。 ヒント -スナップ凍結細胞ペレットであればここに停止し、-80℃で保存します。 </li><li> 4 mLの膨潤バッファー（25mMのHEPES pHは7.8、1.5mMのMgCl 2、10mMの塩化カリウム、0.1％NP40。1mMのDTT、完全なプロテアーゼ阻害剤と使用前に氷上で寒さを追加）で細胞ペレットを再懸濁し、15に転送するmLコニカルチューブ。 ヒント -この膨潤バッファーの量は、6プレートプール（〜6月9日× 10 7細胞）に適しています。多かれ少なかれ、バッファがdouncing効率が変わることがあります。 </li><li> 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>あらかじめ冷却した15 mLのdouncer（ウィートン）に懸濁液を移すと乳棒Aで20ストロークをダウンス</li><li>転送には氷の上に15 mLコニカルチューブに戻し、細胞をdounced。 </li><li> 4℃で5分間2500rpmで遠心℃、上清を捨てる。 </li><li>超音波の緩衝液3mlで核ペレットを（6枚から〜200μL）（15ペレットの量）（50mMのHEPES pHは7.9、140mMのNaCl、1mMのEDTA、1％トリトンX - 100、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、再懸濁します。 0.1％SDS。）使用直前に氷の上で完全なプロテアーゼ阻害剤と寒さを追加。 ヒント -この超音波処理バッファーの量は、6プレートプール（〜6月9日× 10 7細胞）に適しています。多かれ少なかれバッファは、超音波処理の効率が変わることがあります。 </li><li>マイクロチップのついたMisonixのソニケーター3000を使用して10サイクル（20秒8の設定on/40秒オフ/振幅）を氷上で核懸濁液を超音波処理してください。これは、通常サイズで200〜1000 bpsを平均化クロマチンの断片をもたらす。 ヒント - sonicatorsが異なるため、超音波処理の効率が経験的に決定する必要があります。そのためには、超音波処理の前に、各超音波処理のサイクル後に20μLのアリコートを取る。 4時間65℃で、これらのサンプルを加熱する。 DNAのローディングバッファーを追加し、DNA断片を可視化するために標準の1％アガロース/ TBEゲルを実行してください。） </li><li>転送は、4℃で20分間SS34遠心管と遠心する材料を超音波処理° SS34ローター（ソーバルRC6プラス遠心）で13000rpmでCペレットに、通常細胞の残骸の小さい量が何であるか。 </li><li>慎重に氷の上に15 mLコニカルチューブに上清を移す。 </li><li> 360μLサケ精子DNA /プロテインAまたはGアガロースビーズのスラリーを追加し、少なくとも30分間、4℃で揺れによる事前クリア。 ヒント -この手順では、非特異的な結合事象から発生するアッセイでのノイズを減少させる。 </li><li>ペレットアガロースビーズへの5分間4℃で1000rpmで遠心する。 </li><li>氷の上に別の15 mLコニカルチューブに上清をあらかじめクリアに転送します。 </li><li>事前にクリアクロマチンのA260ユニットを測定し、4（4）A260ユニット（0.2 mg / mLの1 A260ユニット= 0.050 mg / mlのを前提）に超音波処理バッファーを使用して、音量を調節する ヒント - A260の単位を測定するには、190μlのDDWで事前にクリアクロマチンの10μLの希釈し、190μlのDDWで10μL超音波処理のバッファを持つ空白の分光光度計を。 </li><li> 20℃入力のサンプルとストアとしてクロマチンの75μLを（4 A260単位で）保存° C架橋を逆にする準備が整うまで。 ヒント -この手順では、データ解析のための非常に重要です。入力のアリコートを取ることを無視しないでください。 </li><li>私上を1.7 mLマイクロチューブに分注して調製したクロマチンを1mLのアリコートとしてCE。 ヒント -ここに停止する場合は、-80℃ドライアイスとストアの準備クロマチンを凍結スナップ℃にNBは：可能であれば保存されているクロマチンが少なく、最適な結果よりも生産する、低下することができるので、避けてください。 </li><li>重複の誘導および非誘導サンプルセットへのChIPグレード抗体を追加。誘導および非誘導サンプルセットへの陰性および陽性対照としてIgG抗体（2μg）を、パンヒストンH3抗体（15μL）を追加します。 ヒント -使用する抗体の量は、経験的に決定するかあるいは提案された量のために供給業者の製品のシートを参照してくださいする必要があります。のChIPグレード抗体の一般的に1〜2μgのが適しています。適切なボリュームは、血清として供給される抗体のために経験的に決定する必要があります。 </li><li>一晩4のチューブを揺する℃に</li></ol> PART 2：免疫複合体のCOLLECT <ol><li>すべてのチューブにサケ精子DNA /タンパク質またはプロテインGアガロースビーズのスラリー60μLを加える。 マウスモノクローナル抗体のウサギポリクローナル抗体とプロテインGのためのヒントを使用するタンパク質。 </li><li>少なくとも60分間、4 ° Cでロック。 </li><li> 4℃で2000rpmで静かにmicrofugingによるペレットは免疫複合体（アガロースビーズ）℃で3分間。 </li><li>上清を吸引除去する。 </li><li> 4℃を揺動し、10分間、次洗浄バッファーの各1mLで免疫複合体を洗う4℃、2000rpmで3分間、マイクロ·各洗浄し、上清を吸引間C。氷上で冷却し、サンプルをしてください。使用直前にPMSFを追加。 <ul><li>低塩ウォッシュ - 0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMのトリス- Cl、pHは8.0、150mMのNaCl、1mMのPMSF </li><li>高ソルトウォッシュ - 0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMのトリス- Cl、pHは8.0、500mMのNaCl、1mMのPMSF </li><li>塩化リチウムウォッシュ - 0.25 M塩化リチウム、1％NP - 40、1％デオキシコール酸ナトリウム、1mMのEDTA、10mMのトリス- Cl、pH8.0の、1mMのPMSF </li><li> TEウォッシュ - TEバッファー-10 mMのトリス- Cl、pH8.0の、1mMのEDTA、1mMのPMSFで2回洗浄</li></ul></li><li>最後のTEバッファー洗浄を削除し、ビーズに、500μlの溶出バッファー（50mMのトリス- Cl、pH8.0の、10mMのEDTA、1％SDS）を追加します。 ヒント -溶出バッファーを新しく調製する必要がある。 </li><li> 65℃30分間溶出緩衝液と熱にアガロースビーズを混在させる渦℃に ヒント -この30分間、各チューブは、少なくとも10分おきにボルテックス。 </li><li> 2000rpmで30秒間、マイクロと新しいマイクロ遠心チューブに溶離液を移す。 ヒント -溶出時には、ご入力のサンプルを解凍し、それぞれに500μlの溶出バッファーを追加します。今後すべてのステップでこれらのサンプルが含まれています。 </li><li>すべてのサンプルと渦〜200 mMの最終濃度を5 M NaClを追加します。 </li><li> 65℃で一晩（または少なくとも4時間）。 </li></ol> PART 3：PurifyをChIP'dと入力のDNA <ol><li>蓋に結露を収集するために30秒間のすべてのサンプルをマイクロフュージ。 </li><li> 15分間室温で各チューブとインキュベートしてRNase Aを1μlの（10 U /μL）を追加します。 </li><li> 10μLの0.5 M EDTA、40μL、0.5 Mトリス- Cl pH6.5で、2μLプロテイナーゼK（10 mg / mL）に追加し、45℃で60分間、℃でインキュベートする。ヒントは、これらの試薬のマスターミックスを調製し、各チューブに52μLを加える。 </li><li>フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、クロロホルム/イソアミルアルコールは、サンプルを抽出。 </li><li> 2μLグリコーゲン（25μg/μLの）と3M酢酸Na液（pH5.2）と渦0.1ボリュームを追加します。 </li><li> 100％エタノールと渦の2.5倍量を追加。 </li><li> 20℃で一晩。 </li></ol>パート4：PurifyをChIP'dと入力のDNAつづき<ol><li> 4℃13000rpmで20分以上のための微量サンプル° C DNA /グリコーゲンペレットを沈殿させる。 </li><li> 70％エタノール1mLでDNA /グリコーゲンペレットを洗浄する。 </li><li>空気は、DNA Savant社の高速真空遠心分離でペレットまたは迅速に乾燥して乾燥させる。 ヒント -上のDNAを乾燥させないでください。 </li><li> 200μLのTE緩衝液にDNA /グリコーゲンペレットを再懸濁します。 </li><li> DNA（1μL）は、リアルタイムPCRによる定量のための準備ができています。 20店舗、残りのDNA℃に ヒント - DNA以上の1μLを使用して、リアルタイムPCR反応を阻害することができるので、注意してスケールアップ。 </li></ol>パート5：代表的な結果： チップと入力DNAサンプルは、目的の遺伝子座に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCR 7,8（アプライドバイオシステムズ7500 FastリアルタイムPCRシステムを応用）を用いて定量されています。に濃縮またはアッセイされるヒストン修飾に欠けていることが知られているターゲットのゲノム配列が同様に陽性および陰性コントロールとして使用することができるプライマー。データは入力のパーセントとして表されます。 ChIPの手順は完全にしてくださいR生物はヒストン修飾で報告された変化は統計的に有意であることを保証するために複製うち3 epeated。 プライマー設計、PCRの効率、および入力と正規化手順のパーセントを計算するために適切な方法を含むDNAを、定量化するためにリアルタイムPCRを使用する際に考慮すべきいくつかの重要な問題があります。遺伝子を越えヒストン修飾の占有率をプロファイル化する場合、PCRの効率は、全てのプライマーペア間で一貫している必要があります。リアルタイムPCRシステムのメーカーは、必要な情報とトレーニングを提供することができます。 図1に、クロマチンの代表的な結果は、IFN -γによって引き起こされる、IRF1遺伝子9のSTAT1活性化中に免疫沈降を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2053/2053fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。 STAT1、RNAポリメラーゼIIとH3K36me3の占有はIRF1遺伝子のSTAT1活性化中に動的です。 （A、B、C）α- H3K36me3、α- STAT1と2FTGH細胞から採取したクロマチンのα-ポルIIを持ったチップはIFN -γのための30分（赤い四角）、1.5時間（青丸）、5時間（で誘導緑色の三角形）または非誘導（ブラックダイヤモンド）。 IgGは、ネガティブコントロール（グレー×印）です。（D）パンH3は、ポジティブコントロールであると誘導（青丸）での遺伝子座でヒストン占有および非誘導条件（ブラックダイヤモンド）を示しています。 -5 BP周りディップでは、転写開始部位で発見されたヌクレオソーム枯渇によるものです。

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

概説ChIPのプロトコールは、20を超える異なるヒストン修飾アッセイするために、ラボで正常に使用されています。さらに、我々は転写因子の占有率の変化、いくつかのIFN -γ誘導される遺伝子におけるヒストン修飾酵素、ヒストン修飾やRNAポリメラーゼIIの転写機構を認識するタンパク質を、特徴付けている。我々はまた、癌幹細胞10の分化中にヒストン修飾の変化を特徴づけるための手順を使用している。 チップデータの品質は最終的に使用される抗体の有効性に依存すると抗体の間でかなりのばらつきがある。変更をチップに障害が、そのため、修正が存在しないということを意味すると解釈することができます。また、ChIP実験で観察された特定の変更の変化は、単に近くの残基での追加のヒストン修飾に起因する抗体によるエピトープの認識の変化を反映しているのかもしれない。このため、ChIPの結果は、生物学的結果にヒストン修飾で観測された変化を関連付けるだろうなアプローチで検証する必要があります。これが完了すると、チップは、遺伝子発現の調節に寄与するクロマチンベースのメ​​カニズムを研究する強力な方法です...

<table><tbody><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム/イソアミルアルコール</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini プロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>Cosmic 牛胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3, CT, pan 抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム/イソアミル</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA/Protein A アガロース</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA/Protein G アガロース</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（chip）

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

細胞外リガンドの種類に応じで、STAT（転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）の転写因子は、急速にそれらが単一のチロシン残基1のリン酸化によって活性化される細胞表面の受容体の細胞質に彼らの潜在的な状態から採用されています。そして、彼らは二量体化と成長、分化、恒常性と免疫応答に影響を及ぼす、標的遺伝子の転写を駆動するために核内に移行。当然のことながら、正常な細胞プロセスにおけるそれらの広範な関与を考えると、STATの機能の調節不全は、特に癌2および自己免疫疾患3に、人間の病気に貢献しています。 それはよく転写が4,5クロマチン鋳型への変化によって調節されることを確立されている。これらの変化はATP依存性複合体だけでなく、共有結合性のヒストン修飾とDNAメチル化6の活動が含まれています。遺伝子発現のSTATの活性化が急速かつ一過性でもあるので、STAT依存性遺伝子座における変調クロマチンテンプレートの特定のメカニズムが必要です。これらのメカニズムを定義するには、我々は、ヒストン修飾とSTATシグナルに応答する遺​​伝子座でそれらを生成する酵素活性を特徴づける。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降、STATが活性化する遺伝子の発現にクロマチンにシグナル伝達の研究のための貴重な方法を説明します。

このプロトコルは、クロマチン免疫沈降（ChIP）はシグナル伝達経路によって誘導される転写を調節するクロマチンテンプレートに動的な変化を研究するために使用される方法について説明します。

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

さまざまな細胞外リガンドに応答して、STAT（シグナル伝達・転写活性化因子）転写因子が速やかにリクルートされ...

ChIP実験は、STAT1活性化による遺伝子発現変化の過程で起こるヒストン修飾の動的な変化をモニタリングするために用いられます。転写因子、ヒストン修飾複合体、および転写装置自体の占有率の変化についても、同様の手法で解析可能です。アッセイを開始するには、まず細胞をインターフェロンガンマで刺激してSTAT1シグナルを活性化させ、続いてホルムアルデヒドで細胞を架橋し、回収します。その後、核を単離してソニケーションを行い、クロマチンを約200〜1000塩基対の断片に断片化します。次に、目的のタンパク質またはヒストン修飾を標的とする抗体を添加し、免疫複合体を沈殿させます。免疫複合体を洗浄し、架橋を解除してDNAを精製します。免疫沈降させたDNAの定量リアルタイムPCR解析に基づき、ヒストン修飾の変化や遺伝子の特定領域へのタンパク質のリクルートを決定できます。こんにちは、私はバージニア大学生物学部のMelissa Hendrickson博士の研究室のLauren Borowです。今日は、クロマチン免疫沈降のプロシージャについて解説します。当研究室では、STAT1シグナリングの下流で転写中に起こる動的なヒストン修飾を研究するために、この手法を用いています。それでは始めていきましょう。本手順を開始する1日前までに、ここで使用する2つのFTGH細胞に対して十分な数が得られるように細胞を培養しておきます。チップアッセイ1回につき、コンフルエンシー80%の15cm組織培養ディッシュを1枚用意してください。各実験には、陰性コントロールとしてIgG、陽性コントロールとしてパンヒストン抗体を含め、2連（デュプリケート）で実施してください。この手順を開始するには、培地を除去します。それを、10% cosmic calf serumを添加し、5 ng/mLのinterferon gammaを含む20 mLのDMEMに交換します。また、非誘導プレートの培地を20 mLの10% C-C-S-D-M-E-Mに交換します。次に、ドラフトチャンバー内で作業を行います。15 cmの組織培養皿を傾け、20 mLの培地に37%ホルムアルデヒド溶液を540 µL加えます。その後、プレートを揺らして均一に広げます。室温で10分間放置し、架橋反応を行います。次に、最終濃度が125 millimolarになるようにグリシンを添加し、架橋反応を停止させます。培地を吸引除去し、セルスクレイパーを用いて氷冷PBS 10 millilitersで細胞を1回洗浄します。約7 millilitersのPBSで細胞を回収し、同様の処理を施した6枚の15 centimeterプレートからの細胞を、氷上の50 milliliterコニカルチューブにまとめます。最後に、回収した細胞を4°Cで1,800 RPMで5分間遠心分離し、PBSを吸引します。ここで中断する場合は、クロスリンク後、細胞ペレットを急冷凍結し、-80°Cで保存してください。次のステップはクロマチンの調製です。まず、氷上で冷却したスウェリングバッファーに1 mMのDTTとプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。6枚のプレートから回収したペレットを4 mLのスウェリングバッファーで再懸濁し、15 mLのコニカルチューブに移します。バッファーの量を変更すると、破砕効率が変化する可能性があります。細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。氷上でのインキュベーションが完了したら、懸濁液をあらかじめ冷却した15 mLのダウンナー（downer）に移し、PEs Aを用いて20回ストロークします。ストローク後、細胞を再び氷上の15 mLコニカルチューブに戻し、4°Cで2,500 RPMで5分間遠心分離し、上清を捨てて核ペレットを回収します。氷上で冷却したソニケーションバッファーに、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えます。6枚のプレートから約 200 µL の核ペレット再懸濁液が得られます。ペレットを、ペレット容量の15倍または 3 mL のソニケーションバッファーで懸濁します。この細胞量に対して異なる容量を使用すると、超音波処理の効率が変化する可能性があります。超音波処理の効率は、あらかじめ研究室で使用する装置で決定しておく必要があります。ここでは、マイクロチップを装備したMiss Sonic sonicate 3000を使用しています。核懸濁液を氷上で、振幅設定8にて、20秒間の作動と40秒間の休止を10サイクル繰り返してソニケーションします。これにより、通常、ソニケーション完了時に平均200から1000 base pairsのサイズのクロマチン断片が得られます。ソニケーションした試料をSS 34遠心チューブに移し、4 °Cで13,000 RPMにて20分間遠心分離します。SS 34 rotorを用いて、通常は少量である細胞残渣をペレット化します。上清を氷上の15 mLコニカルチューブに慎重に移します。その後、非特異的結合によるバックグラウンドを減少させるためにチップ処理に進みます。まず、360 µLのサーモン精子DNAプロテインAまたはGアグロビーズスラリーを加え、4 °Cで30分以上回転混和して、クロマチン調製液をプリクリアします。4 °Cで1000 RPMで5分間遠心分離し、アグロビーズをペレット化します。その後、プリクリアした上清を氷上の別の15 mLコニカルチューブに移します。次に、クロマチンの260ナノメートルの吸光度またはA 260値を測定します。10 µLの抽出済みクロマチンを190 µLの二回蒸留水で希釈します。ブランク用として、10 µLのソニケーションバッファーと190 µLの二回蒸留水を混合します。ソニケーションバッファーを用いて、サンプルの量を A 260 単位で 4 に調整します。A 260 単位で 4 に調整したプリクリアクロマチンの 75 µL をインプットサンプルとして保存し、逆架橋を行うまで -20 °C で保管します。このステップはデータ解析において極めて重要であることに留意してください。したがって、入力用分注量を確保することを忘れずに、残りのクロマチン調製液を1 mLずつ1.7 mLマイクロチューブに分注し、氷上で保持します。ここで作業を中断する場合は、調製したクロマチンをドライアイスで急冷凍結し、-80 °Cで保存してください。しかし、保存されたクロマチンは分解する可能性があるため、すぐに免疫沈降（ip）に進むのが最適です。次に、誘導したサンプルセットと誘導していないサンプルセットに、ChIPグレードの抗体を添加します。この操作は2連（duplicate）で行ってください。通常、1〜2 µgの抗体で十分な結果が得られますが、使用量はあらかじめ経験的に決定する必要があります。陰性コントロールとして2 µgのIgGを、陽性コントロールとして15 µLのpan histone H3抗体を、誘導済みおよび未誘導のサンプルセットにそれぞれ添加してください。また、抗体による一晩のインキュベーション後、免疫複合体を単離する前に、すべてのチューブを4 °Cで一晩振盪させてください。すべてのチューブに、60 µLのサーモン精子DNAプロテインAまたはプロテインGビーズスラリーを添加します。免疫複合体をビーズに結合させるため、4 °Cで少なくとも60分間静置します。アガロースビーズに結合した免疫複合体を、4°Cにて2000 RPMで3分間、緩やかに遠心分離してペレット化し、上清を吸引除去します。次に、低塩濃度洗浄から始まり、続いて高塩濃度洗浄、その後リチウムクロリド洗浄という一連のバッファー洗浄を行います。最後に、各洗浄バッファーで2回のTE洗浄を行います。使用直前にPMSFを添加し、1 mLのバッファーを用いて4 °Cで10分間ロッキング混和させます。その後、4 °Cで2000 RPMで3分間遠心分離し、サンプルを氷上で冷却したまま上清を吸引除去します。最後のTEバッファー洗浄後、調製したばかりのLysisバッファー500 µLをビーズに添加し、ボルテックスで混合してArosビーズをLysisバッファーに分散させ、65 °Cで30分間加熱します。サンプルの溶出中に10分ごとにボルテックスを行いながら、投入サンプルを融解させ、それぞれに500 µLの溶出バッファーを加えます。以降のすべての工程にこれらのサンプルを含めてください。サンプルを65 °Cでインキュベートした後、2000 RPMで30秒間マイクロ遠心分離し、EENTを新しいマイクロ遠心チューブに移します。最後に、架橋を解除します。すべてのサンプルに、最終濃度が 200 millimolar となるように 5 molar の塩化ナトリウムを添加し、65 degrees Celsius のボルテックスインキュベーターで、最低 4 時間から一晩までインキュベートします。免疫複合体の架橋が解除されると、65 degrees Celsius でのインキュベーション完了後に結合した DNA を回収することができます。サンプルを30秒間マイクロ遠心分離します。蓋に付着した凝縮物を回収するため、各チューブに1 µLのRNase Aを加え、室温で15分間インキュベートします。その後、各チューブに0.5 M EDTA 10 µL、0.5 M Tris-HCl (pH 6.5) 40 µL、およびProteinase K 2 µL（またはマスターミックスから合計52 µL）を加え、45 °Cで60分間インキュベートします。フェノール・クロロホルムおよびイソアミルアルコールでサンプルを抽出し、その後、クロロホルム・イソアミルアルコールで抽出します。次に、DNAを沈殿させるために、各サンプルに2 µLのグリコゲンと0.1 volumesの3 M 酢酸ナトリウム（pH 5.2）を加え、ボルテックスします。さらに2.5 volumesの100% ethanolを加えてボルテックスし、-20 °Cで一晩インキュベートします。サンプルを回収し、4 °C、13,000 RPMで20分間遠心分離します。DNAグリコーゲンペレットを1 mLの70% ethanolで洗浄し、風乾させるか、スピード真空遠心機を用いて乾燥させる。DNAを乾燥させすぎないように注意し、ペレットを200 µLのTE bufferに再懸濁させ、リアルタイムPCRを用いて1 µL以下で定量する。ここに示すPCRは、H3K36me3のダイナミクスを追跡したChIP実験の結果である。インターフェロンγによるIRF1遺伝子の誘導過程において、インターフェロンγで30分間、1.5時間、および5時間誘導した2tfGH細胞から回収したクロマチンを、H3K36me3抗体を用いてプルダウンし、陰性対照としてIgGを用いた。また、これらの時点におけるSTAT1の占有率およびRNAポリメラーゼIIの占有率についても決定した。pan histone three抗体を用いて、非誘導条件および誘導条件におけるIRF one遺伝子座全体のヒストン占有率を測定しました。この抗体は陽性対照としても機能します。minus five base pairs付近の低下は、転写開始点に見られるヌクレオソームの枯渇によるものです。以上で、クロマチン免疫沈降の手順について説明しました。このアッセイは、活性化された遺伝子転写中に起こるクロマチン修飾を観察するのに有用です。この手順を行う際は、 ChIP実験を開始する前に、指導者と共にクロマチンの剪断手順を確定させることが重要です。また、インプットサンプルを採取することを忘れないでください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。...

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR...

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

ヒストンアセチルトランスビシ酵素(HAT、リジンアセチルトランスビセラーゼとも呼ばれる)の阻害剤は、CBP/p300などの、癌を治療するための潜在的な治療薬です。しかし、これらの阻害剤を検証するための厳格な方法が必要です。検証のための3つのin...

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

学ぶクロマチン免疫沈降法によるヒト細胞の動的ヒストン修飾解析。インターフェロンγ誘導によるSTAT1シグナル伝達経路における転写制御メカニズムを定量PCRで評価する手法です。

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

さらに動画を探す