ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

このチップ実験は、STAT 1活性化遺伝子発現中に発生するヒスト修飾の動的変化を監視するために使用され、転写因子、ヒストン修飾複合体、および転写機構自体の占有の変化もこの方法でアッセイできます。アッセイを開始するには、細胞をインターフェロンガンマで誘導してSTAT 1シグナル伝達を活性化し、細胞をホルムアルデヒドで架橋し、それらを収集した後、核を分離して超音波処理し、クロマチンを約200〜1000塩基対の断片にせん断します。次に、目的のタンパク質または組織修飾を標的とする抗体を添加し、免疫複合体を沈殿させます。

免疫複合体を洗浄し、架橋を逆にしてDNAを精製します。遺伝子の特定の領域への組織修飾またはタンパク質の動員の変化は、免疫沈降DNAの定量的リアルタイムPCR分析に基づいて決定できます。こんにちは、私の名前はバージニア大学のメリッサ・ヘンドリクソン博士の研究室と生物学部のローレン・ボローです。

今日は、クロマチン免疫沈降の手順をご紹介します。私たちの研究室では、この手順を使用して、STAT oneシグナル伝達の下流の転写中に発生する動的な組織修飾を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始する1日前に、ここで使用する2つのFTGH細胞に十分な数が得られるように細胞を培養します。各チップアッセイについて、80%coの流暢さで15cmの組織培養皿を1つ調製します。各実験には、陰性のIgGコントロール、陽性の汎ヒストン抗体コントロールおよび重複が含まれる。

この手順を開始するには、培地を取り出します。10%cosmic Calf Serumを添加し、1ミリリットルあたり5ナノグラムのインターフェロンガンマを含む20ミリリットルのDMEMと交換します。また、非誘導プレート上のメディアを20ミリリットルの10%C-C-S-D-M-E-Mと交換します。

お次はヒュームフードでの作業です。15センチメートルの組織培養皿を傾け、540マイクロリットルの37%ホルムアルデヒド溶液を20ミリリットルの培地に加えます。次に、プレートを揺らして均等に広げます。

室温で10分間を知覚するために架橋を許可します。次に、グリシンを125ミリモルの最終濃度に加えて、架橋反応を停止します。培地を真空吸引し、細胞スクレーパーを使用して10ミリリットルの氷冷PBSで細胞を一度洗浄し、細胞を約7ミリリットルのPBSに集め、氷上の50ミリリットルの円錐管に6つの15センチメートルプレートから同じように処理した細胞を結合します。

最後に、収集した細胞を1, 800RPMで摂氏4度で5分間遠心分離し、PBSを吸引します。ここで停止する場合は、スナップしてセルパレットをフリーズし、クロスリンク後に摂氏マイナス80度で保存します。次のステップは、クロマチンの準備です。

まず、氷上で冷却した膨潤緩衝液に1ミリモルのDTTと完全なプロテアーゼ阻害剤を添加します。Resusは、6つのプレートからペレットを懸濁し、4ミリリットルの膨潤緩衝液を引き込み、15ミリリットルの円錐管に移します。バッファーの使用が多かれ少なかれ、ダンスの効率が変わる可能性があります。

細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。氷上でのインキュベーションが完了したら、懸濁液を事前に冷やした15ミリリットルのダウナーに移して踊ります。ダンスをした後、PEと20ストロークAは、4°Cで5分間、氷の遠心分離機上の15ミリリットルの円錐管に細胞を戻す4°

氷上で冷却した超音波処理緩衝液に完全なプロテアーゼ阻害剤を添加する。6枚のプレートから約200マイクロリットルの核ペレット「レサス」が入る。ペレットを15ペレット容量または3ミリリットルの超音波処理緩衝液に懸濁します。

この量の細胞に異なる体積を使用すると、超音波処理効率が変わる可能性があります。超音波処理効率は、ラボのエーターについて事前に決定する必要があります。ここでは、マイクロチップを搭載したMiss Sonic sonicate 3000を使用しています。

核懸濁液を氷上で10サイクル、20秒間オン、40秒間、振幅を8に設定して超音波処理します。これにより、通常、ソニケーションが完了したときに、クロマチンフラグメントのサイズが平均200〜1000塩基対になります。超音波処理された材料をSS 34遠心分離管に移し、摂氏4度の20分間13, 000RPMで遠心分離します。

SS 34ローターでは、細胞の破片をペレット化しますが、これは通常少量です。スーピネートを氷上の15ミリリットルの円錐管に慎重に移します。チップに進み、非特異的結合イベントによるバックグラウンドを減らします。

まず、360マイクロリットルのサケ精子DNAタンパク質AまたはGアグロビーズスラリーを加え、摂氏4度で少なくとも30分間振盪することにより、クロマチン調製物を事前に透明にします。1000 RPMで摂氏4度で5分間遠心分離し、アグロビーズをペレット化します。次に、事前にクリアされた仰臥位ナチンを氷上の別の15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、260ナノメートルの吸光度またはクロマチンのA260単位を測定します。10マイクロリットルのプレクルードクロマチンを190マイクロリットルの二重蒸留水で希釈します。.ブランクには、10マイクロリットルの超音波処理緩衝液と190マイクロリットルの二重蒸留水を組み合わせる。

超音波処理バッファーでサンプルの量を4つのA 260ユニットに調整します。事前にクリアされたクロマチンを4 a two 60ユニットで75マイクロリットルをインプットサンプルとして保存し、逆架橋の準備ができるまで摂氏マイナス20度で保存します。この手順は、データ分析にとって重要であることを忘れないでください。

したがって、入力アリコートを取ることを怠らず、残りのクロマチン調製物を1ミリリットルのアリコートに分注し、氷上の1.7ミリリットルのマイクロゴミチューブに分配します。ここで止まったら、スナップしてください。調製したクロマチンをドライアイスで凍結し、マイナス80°Cで保存します。

ただし、保存されたクロマチンは分解する可能性があるため、IPを続行するのが最善です。次に、チップグレードの抗体を誘導サンプルセットと非誘導サンプルセットに加えます。重複して。

通常、1〜2マイクログラムの抗体が適していますが、その量は事前に経験的に決定する必要があります。2マイクログラムのIgGと15マイクロリットルのパンヒストンH 3抗体を、陰性および陽性コントロールとして、誘導および非誘導サンプルセットに加えます。同様に、すべてのチューブを摂氏4度で一晩揺さぶってから、抗体との一晩のインキュベーション後に免疫複合体を単離します。

60マイクロリットルのサケ精子DNAプロテインAまたはプロテインギロビーズスラリーをすべてのチューブに加えます。少なくとも60分間、摂氏4度でロケットを打ち上げます。免疫複合体をビーズに結合する。

アグロスビーズに結合した免疫複合体を、2000RPMでマイクロ穏やかに、摂氏4度の吸引で3分間上清にペレット化します。次に、低塩分洗浄から始まり、高塩分洗浄に続く一連のバッファー洗浄を行います。次に塩化リチウムを洗浄します。

そして最後に、各洗浄バッファーに 2 回の TE 洗浄を行います。使用直前にPMSFを添加し、1ミリリットルのバッファーで10分間洗浄し、摂氏4度で2000RPMで3分間振盪し、サンプルを氷上で冷やしたまま上清を吸引します。最終的な茶緩衝液洗浄液を取り除いた後、ビーズ渦に500マイクロリットルの新たに調製したルシアン緩衝液を加えて、ルシアン緩衝液中のアロスビーズを混合し、摂氏65度で30分間加熱します。

サンプルが溶出している間、10分ごとにボルテックスし、入力サンプルを解凍し、それぞれに500マイクロリットルの溶出バッファーを追加します。これらのサンプルを今後のすべての手順に含めます。サンプルが摂氏65度のインキュベーションを終えたら、2000 RPMで30秒ごとにマイクロフュージョンを行い、EENTを新しいマイクロフュージチューブに移します。

最後に、架橋を逆にします。すべてのサンプルに最終濃度200ミリモルに5モルの塩化ナトリウムを加え、ボルテックスインキュベーターを摂氏65度で少なくとも4時間、一晩まで浸します。免疫複合体の架橋が逆になると、摂氏65度でのインキュベーションが完了したときに結合したDNAを回収できます。

マイクロフュージサンプルを30秒間。蓋に結露を捕集するには、各チューブに1マイクロリットルのRNA Aを添加し、RNA処理後15分間室温で各チューブに0.5モルEDTA10マイクロリットル、0.5塩化トリスpH 6.5の40マイクロリットル、およびプロテイナーゼKの2マイクロリットルまたはマスターミックスから合計52マイクロリットルでインキュベートし、摂氏45度で60分間インキュベートします。フェノールクロロホルム、アイソエールアルコール、次にクロロホルムISOマイアルコールでサンプルを抽出します。

次に、DNAを沈殿させるために、2マイクロリットルのグリコーゲンと0.1容量の3モル酢酸ナトリウムを加えます。pH 5.2を各サンプルとボルテックスに、2.5容量の100%エタノールボルテックスを加え、マイナス20°Cで一晩インキュベートします。サンプルを回収し、13, 000 RPMで摂氏4度で20分間

DNAグリコーゲンペレットを1ミリリットルの70%エタノールと空気で洗浄します。ペレットを乾燥させるか、速度真空遠心分離機を使用してください。DNAを過度に乾燥させないでください、200マイクロリットルのTEバッファーにペレットを懸濁し、リアルタイムで1マイクロリットル以下を定量します。

ここに示すPCRは、H3、K、36、ME3のダイナミクスを追ったチップ実験の結果です。IRFのインターフェロンガンマ誘導中に、1つの遺伝子H3K36ME3抗体を使用して、インターフェロンガンマで誘導された2つのFTGH細胞から収集されたクロマチンを30分、1.5時間、およびIgGをネガティブコントロールとして5時間引き下げました。STAT 1の占有率も、RNAポリメラーゼ2の占有率と同様に、これらの時点で決定されました。

IRF 1遺伝子座全体のヒストン占有率は、ポジティブコントロールとしても機能するpanヒストン3抗体を使用して、非誘導条件および誘導条件で決定されました。マイナス5塩基対付近の減少は、転写開始部位で見られるヌクレオソームの枯渇によるものです。クロマチン免疫沈降の手順をお見せしました。

このアッセイは、活性化遺伝子転写中に発生するクロマチン修飾の観察に有用です。この手順を行うときは、チップ実験を開始する前に、atorでクロマチンのせん断手順を解明することが重要です。また、入力サンプルを取ることを忘れないでください。

というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。