Name: どのように文化、レコードとマイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激する（多国間環境協定）へ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぶマイクロ電極アレイを用いた神経ネットワークの培養・記録・刺激法。ラット胎生18日の大脳皮質ニューロンを用いて、長期培養とネットワーク活動の解析を行う。神経科学の研究に有用です。

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我々は、プロトコル上で貴重なコメントを提供するためポッターのグループのメンバーに感謝したいと思います。 、この作品は、神経財団のアメリカアカデミーからCMHへの臨床研究研修フェローシップ、一般医科学研究所（NIGMSからフェローシップによって賄われていた<a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> JDRへ（GM08169） ）、神経疾患のNIH国立研究所からの助成金とストローク（NS054809）、国際緊急援助隊（NS060392）、NSF EFRI助成金（0836017）、コールター財団トランスレーショナルリサーチ賞、とのルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞JDRのトランスレーショナルリサーチのフェローシップ（NS007480）。

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMHは、開示には関係ありません。<br /&gt; JDRとSMPは、アクシオンアプライドバイオシステムズのコンサルタントが支払われます。<br /この記事とビデオ用&gt;投稿料およびビデオ処理手数料は、丁重にマルチチャンネルのシステムによって後援されています。

このプロトコルは、どのように文化と同様に記録し、神経ネットワークを刺激への導入をマイクロ電極アレイ上の神経ネットワークを維持する上での指示を示しています。多国間環境協定から録音するより一般的な問題の一部は、MEAのトラブルシューティングのセクションで議論された。で説明すると、しばしばこれらの変更が特定の実験設計で必要とされる特定の条件を最適化するために利用されるプロトコルで、時々のバリエーションがあります。 ここで紹介する記録と刺激的なシステムがMCSのプリアンプでNeuroRighter 15を設計したカスタムで構成されていますが、神経回路網とのインタフェースを提供できる他の複数のシステムがあります。特定のセットアップを選択すると、特定の実験のニーズに依存します。 単純な記録と刺激の例は、しかし、MEAの上にこれらの培養物は、シナプス活性と神経回路網の接続に関する複雑な問題への洞察を提供するために使用できるこのプロトコルで提供されていました。上記のように、進行中の仕事は、細胞可塑性、開発、興奮毒性および神経変性のようなプロセスを研究するためにこの技術を利用している述べた。6-10は例えば、我々の研究室から最近の出版物はでリアルタイム閉ループの刺激とin vitroでの学習の指示再現可能な目標を示した現在の神経回路網の活動3に応答。 MEAの文化はしばしば凝り性で繊細なものですが、そのシンプルさとアクセシビリティ（インタクトな動物と比較して）のおかげで、彼らはネットワークレベルでの神経活動を研究するための強力なモデルを提供しています。

電源<ul><li>使い捨てボトルトップフィルター（150ミリリットル、0.2μmの細孔径; Nalgene＃565〜0020） </li><li>胎生18日時限妊娠雌ラット</li><li>微小電極アレイ（B1、プロトコルの説明を参照） </li><li>微小電極アレイの蓋（プロトコル、B3の説明を参照してください） </li><li>ナイロンセルストレーナー（40μmの、BDファルコン、＃352340） </li><li>ポリプロピレンコニカルバイアル（無菌、15ミリリットル） </li><li>ポリスチレンシャーレ（滅菌、35mmと100x15mm） </li><li>ピペットチップ（滅菌、20μlの、200μlのと1000μl） </li><li>血清学的ピペット（5ml）を</li></ul>設備： <ul><li>生物学的安全キャビネット/層流フード</li><li>セルカウンター</li><li>遠心</li><li>氷の容器</li><li>解剖ハサミや鉗子（滅菌） </li><li>層流フードの解剖顕微鏡</li><li>ハンドヘルド電気pipetman </li><li>血球計</li><li>イソフルランとガス室</li><li>光顕微鏡</li><li>ハンドヘルドpipetman（P - 20（20μlの）、P - 200（200μlの）、P - 1000（1000μl）） </li><li> MEA記録方式（プロトコルの説明を参照して、D1） </li><li>げっ歯類のギロチン</li><li>トライガスインキュベーター（プロトコル、B15の説明を参照してください） </li><li>フードに取り付けられアスピレーターで真空フラスコ</li><li>渦</li><li>水浴（35〜37 ° C） </li></ul>ソリューションと試薬： BSA溶液： 5％を作るリン酸のBSA（シグマ9418）は、生理食塩水pH7.4の緩衝化し、0.2μmのでろ過。このソリューションは、事前に準備され、数ヶ月間、4℃で保存することができる。 セルメディア： 90ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（アーバインサイエンティフィック9024）、10mlのウマ血清（ギブコ16050）、1mlのピルビン酸ナトリウム（100mMの、ギブコ11360）、250μlのグルタミン（ギブコ35050）、及びインスリンを（最終濃度2.5μg/ mlの、組み合わせるシグマI - 5500）は、0.2μmのfilter.22ウォームを通過し、使用前にインキュベーターで細胞の培地を平衡化してください。 パパイン溶液を調製するための解剖ソリューション：23 <table border="1"><tr><td>解剖液（100ミリリットル株） </td><td> 4で、順番に0.22μmのフィルターと店舗を組み合わせた℃に</td><td></td></tr><tr><td>コンポーネント</td><td>ボリュームミリリットル</td><td>最終濃度（mM）を</td></tr><tr><td>ダブル蒸留水</td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2の </td><td> 0.58 </td><td> 5.8 mMの</td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2を </td><td> 0.025 </td><td> 0.25 mMの</td></tr><tr><td> 0.5 MのHEPES </td><td> 0.32 </td><td> 1.6mmの</td></tr><tr><td> 0.5パーセントフェノールレッド</td><td> 0.2 </td><td> （0.001％） </td></tr><tr><td> 0.1N NaOHを</td><td> 0.2 </td><td> 0.2mMの</td></tr><tr><td> 2 M硫酸ナトリウム</td><td> 4.5 </td><td> 90 mmの</td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30mMの</td></tr><tr><td> 0.1 Mキヌレン酸</td><td> 1.0 </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> 5mMのAPV </td><td> 1.0 </td><td> 0.05mMの</td></tr></table>このソリューションは、事前に準備され、数ヶ月間、4℃で保存することができる。 DNアーゼI： インビトロジェン（＃18047019）。 50μlのアリコートを-80℃で凍結点滅し、保存されていますアリコートを細胞解離のプロセスを開始する前に、層流フードで解凍されています。 ハンクス平衡塩溶液： シグマ（＃4891）。 1X溶液を滅菌0.2μmのでフィルタリングし、4℃で保存したが、脱イオン水中で調製され Hibernateのソリューション： 培養の日に準備する。 2ミリリットルB - 27サプリメント（50X、Invitrogen社＃17504）、0.2μmのフィルターで98ミリリットル、L - 15培地（インビトロジェン11415）を組み合わせる。 ラミニンのソリューション： 培養の日に準備する。 0.02mg/mlの最終濃度980μLの細胞培地中でラミニンの20μlのを（1mg/ml、Sigma社L - 2020）で希釈します。ラミニン（1mg/ml）を20μlのアリコートを-80℃で保存し、使用直前に解凍されています。急速解凍は、時々ラミニンのゲル化を招く可能性が融解はベンチの上ではなく、水浴中で発生する必要があります。 パパイン液：23 解剖のソリューションの暖かい10ミリリットル（上記）30〜32℃まで200台パパイン（シグマP - 4762）および1.6 mgのL -システイン（シグマC - 7880）を追加します。 0.1 N NaOHを約14μlを7.4にpHを調整する。ソリューションのCLまで約30分間インキュベート耳、0.2μmのフィルター、-80℃で15 mlのポリプロピレン製滅菌コニカルバイアルとストアの2 mlのアリコートにおける液体窒素でフラッシュ凍結℃の° Cより前のプロトコルを開始するまで35から37にアリコートを解凍。 ポリエチレンイミン（PEI）解決策：13 PEIの100μlの（50％w / vの、シグマP - 3143）が0.05％の最終濃度w / vのために100mlのホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1 M pHは8.4、シグマB - 9876）で希釈し、 0.2μmので無菌フィルター。これは、事前に準備され、月間4℃で保存することができる。 滅菌脱イオン水： オートクレーブし、使用前に室温まで冷却することができます。 トリプシン（EDTA、ギブコ25200 0.25％）： 1ミリリットルのアリコートを-80℃で凍結点滅し、保存されていますアリコートは、使用前に35から37℃の水浴中で解凍されています。

どのように文化、レコードとマイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激する（多国間環境協定）へ

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

最後の世紀のために、世界中の多くの神経科学者は神経回路網がどのように働くかを理解するために命を捧げていると、なぜ彼らは様々な疾患に動作しなくなるものがあります。研究は、神経病理学的観察、遺伝標識と蛍光顕微鏡、および解離神経細胞やスライス標本の両方で細胞内記録を含めました。このプロトコルは、マイクロ電極アレイ（マルチ電極アレイも呼ばれ、MEAの）上に成長解離ニューロン培養を伴う別の技術を、説明します。 他の技術よりもこのシステムを使用する複数の利点があります。多国間環境協定上の解離ニューロン培養では、ネットワークアクティビティがアレイの複数の電極を介して電気刺激シーケンスで操作可能な単純化したモデルを提供しています。ネットワークが小規模であるため、刺激の影響はそのまま調剤の場合ではない、観測可能な領域に制限されています。細胞は様々なイメージング技術を使用して監視する形態の変化が容易に単層に成長する。最後に、多国間環境協定上の文化は他の培養技術に固有の任意の明確な時間の制限を削除するin vitroで一年以上生き延びることができる1。 世界中の私たちの研究室や他の人は神経回路網に関する重要な質問をするこの技術を利用しています。このプロトコルの目的は、世話、セットアップから録音すると電気的に多国間での文化を刺激するために必要な情報を提供することです。ネットワークで生理学的に関連する質問をするとのより良い理解につながる細胞レベルのための手段を提供するin vitroでのネットワークでは脳機能と機能不全。

このプロトコルは、セットアップの世話から、記録と電気的に多国間での文化を刺激するために必要な情報を提供します。<em&gt;試験管内で</em&gt;ネットワークは、脳機能と機能障害のより良い理解につながるネットワークと細胞レベルでの生理学的に関連する質問をするための手段を提供します。

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

この手順の全体的な目標は、マイクロ電極アレイ上のニューロンネットワークを培養、記録、および刺激することです。これは、最初に培養用の試薬と微小電極アレイを調製することによって達成されます。手順の2番目のステップは、18日目のラット胚から皮質ニューロンを解離することです。手順の3番目のステップは、微小電極アレイにニューロンをプレートし、2〜3週間培養することです。手順の最後のステップは、微小電極アレイからの刺激と記録を介してニューロンネットワークを実験することです。最終的には、微小電極アレイ上での細心の細胞培養を通じて、記録および刺激ソフトウェアを使用して、ニューロンネットワークにおける自発的および刺激誘発活動を示す結果を得ることができます。こんにちは、スティーブ・ポッター教授です。私は、ジョージア工科大学の生物医学工学科の神経工学研究所の所長です。その部門はエモリー大学医学部と共有されています。私はチャド・ヘイルズ、ポッター博士の研究室のポスドクです。また、エモリー大学医学部神経学部の認知行動学フェローでもあります。今日は、マルチ電極アレイ上のニューロンの培養とケアの方法をご紹介します。こんな感じ。これらを用いて、in vitroでの学習や記憶、ネットワーク情報処理の研究を行っています。それでは始めましょう 層流フードでは、100ミリメートルのペトリ皿に静止した清潔で無菌のMEAの中心に、マルチチャネルシステムのマイクロ電極アレイまたはMEAピペット100マイクロリットルのポリエチレンアミンを準備し始めて、電極の損傷を防ぎます。MEA表面に固い物体に触れないでください。気体透過性テフロン膜を取り付けた滅菌蓋で皿を軽く覆い、フード内で30分間インキュベートします。テフロン膜の蓋は、最小限の蒸発でガス交換を可能にし、低湿度環境での培養を可能にします。湿度が低いため、インキュベーター内で繊細な電子機器を使用することができ、汚染率が低下します。PEIを吸引し、1〜2ミリリットルの滅菌脱イオン水でMEAを3回すすぎます。フードの蓋を外した状態で、少なくとも30分間、または完全に乾くまで乾かします。このプロトコルのテキスト部分で説明されているように、E 18皮質ニューロンの解離を完了します。濾過後に細胞を濾します。細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞培地で細胞懸濁液の量を慎重に4ミリリットルにします。細胞懸濁液の下に500マイクロリットルの500マイクロリットルのBSA溶液を200Gで6分間遠心分離します。細胞が回転している間、MEAが完全に乾いていることを確認してください。20マイクロリットルのラミネート溶液をMEAの中央に慎重にピペットで移します。気泡の侵入を避け、すべての電極が覆われていることを確認してください。ラミニンの蒸発を防ぐために、テフロン蓋をMEAにそっと置きます。蓋をするときは、MEAは完全に平らな面にある必要があります。そうしないと、圧力によってアレイのガラス底にひびが入る可能性があります。摂氏35〜37度、二酸化炭素5%、酸素9%、湿度65%で20分間インキュベートします。次に、スピンしたセルをフードに移します。細胞ペレットがチューブの底に見えるはずです。ペレット化が不完全な場合に備えて、上清を取り出して予約します。ペレットを静かに再懸濁します。ヘモサイトメーターで懸濁液10マイクロリットル中の細胞数を数え、懸濁液を所望の濃度に希釈します。通常、細胞培地でマイクロリットルあたり1000〜3000個の細胞。アレイのラミネートインキュベーションが完了したら、すぐに液滴を吸引します。MEAのラミネートコーティング領域上の細胞懸濁液の15〜20マイクロリットルをピペットで披露します。皿をテフロン蓋で覆い、インキュベーターに30分間置きます。位相差顕微鏡で皿を検査し、細胞が付着し、すべての電極を覆っていることを確認します。カバレッジが不完全な場合は、細胞をさらに追加して再インキュベートします。1ミリリットルの温めた平衡化細胞培地を皿にゆっくりと浸します。テフロン蓋を元に戻し、皿をインキュベーターに24時間戻します。翌日。位相差顕微鏡下で、培養細胞が付着していること、および適切な手入れと給餌により破片と細胞死の量が制限されていることを確認します。添付のテキストで説明されているように、この方法で培養されたニューロンは1年以上生存することができます。2〜3週間後、培養物は活動の安定した状態に達し、このビデオから記録することができますカスタムメイドのニューロライタープログラムでの記録を実演します。皿を再び摂氏35〜37度、二酸化炭素5%、酸素9%、湿度65%に保たれた記録インキュベーターに移します。理想的な温度とpHを維持するために、皿を移動するときは、皿を地面と平行に運び、細胞が基質から離れる可能性のある素早い動きを避けてください。MEAを皿から持ち上げて、マルチチャネルシステムに配置します。プリエムを録音する amplifier、内部アースとPreem amplifierのアースに適切に一致していることを確認してください。プリアンプは、ここで添付のテキストで説明されているように、熱を放散する機能を持つペルトデバイス上に座っており、プリアンプはインキュベーターから移動されています。皿の適切な座席をよりよく示してください。70%エタノールで湿らせたワイプを使用して、アレイの周囲の接点を清掃します。MEAが適切に取り付けられていることを確認し、蓋を下げてラッチします。必要に応じて、綿棒を使用してアレイの接点を位置合わせします。ニューロライターで、実験に適した設定を選択します。レコードスイッチは上に開く必要があります。データをファイルに書き込むには、開始ボタンをクリックして録音を開始します。スパイクスクリーンには、活動の実行中のトレースとバックグラウンドノイズが表示され、時折活動電位と活動のバーストが表示されます。電極のノイズが多すぎると、プリアンプの蓋のピンの位置がずれている、ゴミの小片、媒体の滴、電極表面の劣化、または蓋からの透明な膜の重なりが接触を乱している可能性があります。コンタクトピンを確認し、必要に応じて70%エタノールに浸した綿棒で調整します。[Spike Waveform]タブをクリックすると、画面ビューがスパイク検出モードに変更され、活動電位が静止した3ミリ秒のウィンドウで表示されます。MEAのニューロンネットワークを刺激するには、記録設定タブでサルパアルゴリズムをトレーニングして刺激アーティファクトを制限し、オンライン設定タブでサルパをアクティブにします。記録が開始されたら、STEMタブをクリックして、開ループプログラムを使用して1つの電極を刺激し、皿内の応答を監視するための適切な刺激パラダイムを設定します。オープンループセクションで適切な設定を選択し、スタートを押します。メインの「spikes」タブと「spike wave forms」タブで応答を可視化します。この動画では、in vitroの7日目の神経細胞とグリア細胞が成長し、MEA上で接続されたネットワークを形成する様子が可視化されています。これは、ニューロンネットワークからの2分間の自発的な活動のラスタープロットです。各黒い点は活動電位を表します。アクティビティの 2 つのバーストは、青い矢印で示されます。複数の電極を介した応答は、ネットワーク接続の関数です。これは、16秒間の刺激誘発活動のラスタープロットです。赤い星は刺激を表しています。赤い矢印は、複数の電極でシナプス活動のバーストを成功裏に誘導した5つの刺激を示しています。時折、刺激がバーストをもたらさないことがあります。青い矢印では、微小電極アレイ上のニューロンネットワークを培養し、記録し、刺激する方法を紹介しました。おそらく最も重要なことは、培養物が感染するのを防ぎ、蒸発を減らすことです。このように半透膜の蓋を使用すると、密閉され、蒸発や感染を防ぎ、数か月、場合によっては1年以上培養できる可能性があります。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。

how-to-culture-record-stimulate-neuronal-networks-on-micro-electrode

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

皮質における臨界​​状態のダイナミクスを示す神経雪崩、すなわちスケール不変時空間アクティビティのバーストを、勉強するための確実な方法。雪崩は、正確に制御された条件下で平面統合マルチ電極アレイ（MEA）との活動の長期的な測定を可能にする培養皮質の浅層の開発に自発的に出現する。...

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

このビデオは、海馬ニューロンを持つ平面微小電極アレイに結合した3Dニューロン培養の発達を示しています。単離されたニューロンは、微小電極アレイの活性領域上に2Dネットワークを形成し、メンブレンインサートを備えたマルチウェルプレート内のガラスマイクロビーズに付着します。これらのニューロンでコーティングされたマイクロビーズを電極に移すと、それらは相互接続された3Dニューラルネットワークに組織化されます。...

微小電極アレイに結合した3次元神経回路網の構築

このビデオは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に由来するニューロンの電気生理学的活動を記録するために、微小電極アレイ(MEA)を使用する方法を示しています。ニューロン-アストロサイト共培養物を含むマルチウェルMEAからの電気生理学的活性は、ネットワーク内の複数のニューロンからの活動電位を検出するために記録され、hiPS細胞のニューロンへの分化が成功したことを確認しています。...

微小電極アレイを用いた神経回路網の電気生理活性の測定

このビデオは、一次マウススパイラル神経節ニューロン(SGN)培養からの自発的および刺激依存的な神経活動を多電極アレイ(MEA)で記録する方法を示しています。これには、MEAの洗浄と準備、自発的な神経活動の記録、および刺激依存性のニューロン活動を特定するための制御された電気刺激の適用が含まれます。...

多電極アレイを用いた初代マウス渦巻神経節ニューロンの神経活動の解析

このビデオは、多電極アレイまたはMEAデバイスを使用してキャプチャされた、脊髄切片の器官型共培養からの電気生理学的記録を示しています。これらの記録は、スライス間のニューロン再生を評価します。観察された同期した電気的活動は、神経再生の成功を裏付けています。...

共培養脊髄切片におけるニューロン再生を評価するための電気生理学的記録

このビデオでは、多電極アレイ(MEA)を使用して3D共培養球のシナプス生理機能を測定する手順を示しています。この方法により、3D球体内のニューラルネットワークダイナミクスとシナプスネットワークバースト活動を理解することができます。...

多電極アレイを用いた3D共培養球のシナプス生理機能の測定

このビデオは、ニューロンネットワーク活動を記録するためのニューロン-アストロサイト共培養の確立を示しています。運動ニューロンとアストロサイトの共培養を多電極アレイ(MEA)プレート上に確立すると、ニューロンネットワークの同期リズミカルな電気的活動がMEAを使用して細胞外に記録されました。...

ニューロン-アストロサイト共培養におけるニューロンネットワークの電気生理学的活性の記録

この研究では、3Dニューロン培養物が平面微小電極アレイ(MEA)に結合される新しい実験モデルpresented.

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

私たちは、ニューロンの応答プロファイルを研究し、刺激パラメータを最適化するために、多電極アレイ上で一次マウススパイラル神経節ニューロン外植片を培養するためのプロトコルを提示します。このような研究は、人工内耳のニューロン電極インターフェースを改善して、患者の聴覚とデバイスのエネルギー消費に利益をもたらすことを目的としています。...

マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

多電極アレイ上で培養されたマウス神経細胞は、電気刺激後の応答の増加を示す。このプロトコルは、ニューロンを培養する方法、活動を記録する方法、および刺激のパターンに応答するようにネットワークを訓練するプロトコルを確立する方法を示す。...

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。...

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース

学ぶマイクロ電極アレイを用いた神経ネットワークの培養・記録・刺激法。ラット胎生18日の大脳皮質ニューロンを用いて、長期培養とネットワーク活動の解析を行う。神経科学の研究に有用です。

どのように文化、レコードとマイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激する（多国間環境協定）へ

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