Name: マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: 学ぶマイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析。間接標識法でバイアスを抑え、Cy3とCy5蛍光色素を用いて変異株と野生型の発現差を正確に検出する実験手法を解説します。

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転写酵素反応を逆に 70から80への加熱ブロックを回し° Cと42℃水浴も、このステップで使用することができます。加熱ブロックを使用する場合、熱が均一になるように水を入れる。 <ol><li>プライミング反応<ol><li> RNAの3μgを取る</li><li> RNaseフリーの水で13μlにボリュームを調整</li><li>ランダムヘキサマープライマー（2mg/mL）2.5μlを加え、 </li></ol></li><li>よく混和して、8分間70〜80℃でインキュベートする。その後、氷上で5分間置きます。 </li><li> RTカクテルを（14.5μL/ RXN）を準備します。 <table border="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 5Xファーストストランドバッファー</td><td> 6μlの</td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 3μlの</td></tr><tr><td> 25Xアミノアリル- dNTPミックス</td><td> 1.2μL </td></tr><tr><td>のSuperScript II RT（200U/μl） </td><td> 2.3μL </td></tr><tr><td>水 </td><td> 2.0μL </td></tr></tbody></table> * nの反応では、あなたが不足しないことを保証するためにカクテルのn個の0.5アリコートのためにマスターミックスを調製する。 </li><li>冷却反応は14.5μlを添加します。 </li><li>ミックス（ボルテックスしない）と℃で3-4時間、42でインキュベート</li><li>必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。 </li></ol>加水分解RNA <ol><li>各サンプルに、1 N NaOH及び0.5 M EDTAを0.6μlの3μlを加える。 （決勝conc.s = 100mMのNaOHを、10mMのEDTA） </li><li>混合し、インキュベート65℃で10分間。 </li><li> 33.6μlの1M HEPESを添加することにより中和、pH値= 7.0（最終濃度.=約500mmのHEPES） </li><li>サンプルは、必要に応じて-20℃で保存することができます。 </li></ol>反応の精製：非法人AA - dUTPの除去と、遊離アミン 注 ：この精製プロトコールは、キアゲンQIAクイックのPCRpurificationキットのプロトコルから変更されます。キアゲンのバッファがCyの染料のカップリング反応と競合する遊離アミンを含んでいるため、リン酸塩の洗浄および溶出バッファーは、キアゲン供給されたバッファに代入されます。ミニプレップキットから列を使用することもできます。 <ol><li> 300μlの（または5X反応体積= 336μl）のバッファーPB（キアゲン付属）でcDNA反応を混合し、QIAクイックカラムに移す。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにカラム（キアゲン社提供）を配置し、1分間〜13,000 rpmで遠心する。空のコレクションチューブ。 </li><li>洗浄のため、1分間〜13,000 rpmでカラムと遠心に750μlのリン酸塩の洗浄バッファー（ではないQiagenの）を追加します。 </li><li>コレクションチューブを空にし、750μlの洗浄と遠心分離のステップを繰り返します。 </li><li>コレクションチューブを空にし、列の最大速度で、追加1分遠心する。 </li><li>新しい1.5mlマイクロチューブにカラムを移し、慎重に、30μlのリン酸塩の溶出バッファーを添加します。 （溶液調製の項を参照） </li><li>室温で1分間インキュベートする。 </li><li> 1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。 </li><li>手順6〜8を繰り返すことによって、同じチューブにもう一度（リン酸塩の溶出バッファーの別の30μlのある）溶出。最後の溶出量は約60μLにする必要があります。 </li><li> cDNAの量は、この段階で定量することができる。 ngのcDNAを=（希釈率）（OD260）（37）（カラムから溶出した総量） </li><li> 45℃VACスピードで乾燥したサンプル℃に</li><li>必要に応じてサンプルを-20℃で保存することができます。 </li></ol>ダイエステルをCyにAA - cDNAのカップリング<ol><li>再懸濁し、10μlの50mMのナトリウム - 炭酸水素塩、pH値= 9.0、必要に応じてcDNAをアミノアリル標識。 （このバッファは隔週で新鮮なされるべきである） </li><li>暗い場所での作業、適切なのCy色素のチューブにプローブを追加します。ピペッティングを数回は、色素を再懸濁します。 </li><li>室温、暗所で1時間反応をインキュベートする。 （インキュベーションは、2時間ほど行くことができる） </li></ol>反応精製II：非結合色素の除去<ol><li>反応に35μlの100mMのNaOAcのpHは5.2を追加します。充分に混合する。 </li><li>ピペッティングすることにより、各試料と混合して250μlの（または5X反応体積= 225μl）をバッファPB（キアゲン付属）を追加します。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにQIAクイックスピンカラム（キアゲン社提供）を配置し、カラムにサンプルを適用し、1分間〜13,000間遠心。空のコレクションチューブ。 </li><li>洗浄のため、1分間〜13,000で、列と遠心に0.75 mlのBuffer PE（キアゲン付属）を追加します。 </li><li>手順4を繰り返します。 </li><li>空のコレクションチューブと最大速度で追加の1分間の遠心カラム。 </li><li>場所は、新しい1.5 mlマイクロ遠心チューブ内の列と慎重にカラムのメンブレンの中央に30μlのBuffer EB（Qiagen社提供）を追加します。 </li><li>室温で1分間インキュベートする。 </li><li> 1分間〜13,000 rpmで遠心分離して溶出します。 </li><li>繰り返すことによって、同じチューブに二度目の溶出ステップ7-9最後の溶出量は約60μLにする必要があります。 </li></ol>ラベリング反応の解析 cDNAの量とラベルは、この段階で定量することができる。 <ul><li> OD 260、550、650（ブランクは水です。）㈱エルマイクロアレイのプログラムを使用して測定します。 </li><li>染料の取り込みと下記の式でpmolのDNAと色素/ NUC比のpmolを計算します。 pmolのヌクレオチド= [OD 260 *体積（μL）* 37 ng /μLの* 1000 PG / NG] / 324.5 PG / pmolの</li></ul> 注 ：1 OD260 cDNAのための= 37 ng /μLの、dNTPの324.5 PG / pmolの平均分子量） pmolのCy3標識= OD550 *体積（μL）/ 0.15 pmolのCy5標識= OD650 *体積（μL）/ 0.25 ヌクレオチド/染料比= pmolのピコモル/ cDNAのCyの染料あなたが光度計を使用している場合、それはすでにμL/ pmolの各色素のために与える。あなただけの合計pmolの色素の取り込みを取得するにはボリュームでこの数値を乗算する必要があります。 注 ：染料、サンプルあたりの取り込みと20未満のヌクレオチド/色素分子の比率の&gt; 150から200 pmolのは、ハイブリダイゼーションに最適です。 <ul><li>サンプルは、暗所で-20℃で保存することができます。 <ul><li>一緒にハイブリダイズするプローブを組み合わせて、42℃speedvacでダウン乾燥℃の</li><li>サンプルはふたに準備するまで-20℃で保存することができます。 </li></ul></li></ul>プリふたのスライド<ol><li> 3-5分のためのクリーン赤スライドホルダーの場所のスライド側を下にRT以上100mLの水</li><li>数秒のために100℃の加熱ブロックに表向きに配置することにより、スライドを乾燥させるスナップ - 結露が消えるまで待ってください</li><li> UVクロスリンク250 mJoules（UVクロスリンカーに2500を入力してください）​​で、スライド</li><li>予め温めておいた42℃の水中に浸漬することによって水和物スライド。 RTで700 RPMで5分間スピン。 </li><li>必要に応じて、少なくとも45分@ 42℃、およびインキュベーションのために予め温めておいたプリふた（5XSSC、1％BSA、0.1％SDS）を含む50ミリリットルコプリンジャーにスライドをインキュベートすると、長く行くことができます。 50mLのプリふたバッファ：12.5 mLを20 × SSC 10 mlの5％BSA、0.5 mlの10％SDS、27 mLの水 </li><li>ディップ予め温めておいた水（42℃）でのスライドとは、事前にふたのバッファを削除するには、数分撹拌。 </li><li>乾燥するために、イソプロパノール及び700rpmで、室温でスピン5分にすすいでください。 </li></ol>ハイブリダイゼーションのためのサンプルの準備<ol><li>水に再懸プローブ（ボリュームが下与えられます） <table border="0"><tbody><tr><td>合計巻用。 =30μlの </td><td>合計巻用。 =35μl </td><td>合計巻.=40μlのための </td><td></td></tr><tr><td> 19.8μlの水 </td><td> 23.55μlの水 </td><td> 27.2μlの水 </td><td> </td></tr><tr><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 1.5μL </td><td> 10 mg / mlのサケ精子DNA（Invitrogen社） </td></tr><tr><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 1.2μL </td><td> 12.5 mg / mlのtRNAの</td></tr><tr><td> 4.5μL </td><td> 5.25μL </td><td> 6μlの</td><td> 20XSSC（3X最終） </td></tr><tr><td> 3μlの</td><td> μlを3.5 </td><td> 4μlの</td><td> 1％SDS </td></tr></tbody></table> 注 ：試薬の添加の順序は重要です。マスターミックスを調製してください。 </li><li> 5分間沸騰し、14,000 rpmで5分をスピン。室温で2分間冷却してください。 </li></ol>交配<ol><li>各辺上と真ん中のハイブリダイゼーションチャンバーのウェルに3倍SSC 10〜12μlを添加する。 </li><li>スライドの適切な領域にクリーンリフタースリップを加え、穏やかにハイブリダイゼーション溶液（30 -40μL）でロードする。カバースリップのどちらかの端に余分なサンプルがあるはずです。 </li><li>チャンバー内のスライドを置きます。一晩65℃の水浴中にネジと場所を締めます。水浴の底に直接チャンバーを置かないでください。場所のすべてを保持するために一番上のチャンバーの上にブロックを置きます。光に敏感なサンプルを保護するために水浴上で蓋をしてください。 </li></ol>ふたは洗浄<ol><li>以下のバッファを準備します。 <ul><li> 1X SSC、0.05％SDS </li><li> 0.06 X SSC </li></ul></li><li>インキュベーション開封ハイブリダイゼーションチャンバーの後。カバースリップを乱さないように注意しながら、チャンバーからスライドを削除します。 </li><li>カバースリップを削除するには、暖かい1X SSC、皿の底に直面して0.05​​％SDSの洗浄緩衝液のカバーを含む皿に浸すのスライド。カバースリップは、サイドにスライド側を移動して減少していきます。 </li><li>カバースリップを除去した後、ラックのスライド暖かい1XSSCm 0.05％SDSで新鮮なお風呂を配置。数分間攪拌する</li><li> 0.06 X SSCのお風呂にスライドに加えてラックを転送します。 </li><li>別のBAにスライドを移し0.06 X SSCは、新鮮なお風呂に入れる前に、できるだけ多くのSDSを含む緩衝液を除去するためにペーパータオルでスライドをブロッティング、新鮮なラックを含むの目。 </li><li>分のカップルのためのスライドを振とうする。 </li><li> 5分@ 700rpmで室温ですぐにスピンして、スライドにはスキャンする準備が整いました。スキャンするまで暗所で保管してください。 </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-アミノアリル)-2&amp;rsquo;デオキシウリジン-5&amp;rsquo;-三リン酸</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>100 mM dNTPセット PCRグレード</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマープライマー</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>ポストラベリング反応性色素パック</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR精製キット</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>1M リン酸バッファー（KPO4, pH 8.5-8.7）の調製法：9.5 mL 1M K2HPO4と0.5 ml 1M KH2PO4を混合する</td></tr><tr><td>リン酸洗浄バッファー</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>リン酸洗浄バッファー（5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH）100 mLの調製法：0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ水 + 84.25 mL 95% エタノールを混合する。洗浄バッファーはわずかに白濁する。**重要：リン酸洗浄バッファーは毎日調製すること。</td></tr><tr><td>リン酸溶出バッファー</td><td>バッファー</td><td></td><td></td><td>1 M KPO4, pH 8.5を滅菌水で4 mMに希釈する</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウムバッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3)：0.5M, pH 9.0。4.2 g NaHCO3を80 mLの滅菌水に溶解させ、10 N NaOHでpH 9.0に調整し、滅菌水で100 mLにメスアップする。色素カップリング反応用の50 mM溶液を作成するには、水で1:10に希釈する。注意：炭酸バッファーは時間とともに組成が変化するため、2週間から1ヶ月ごとに新しく調製すること。</td></tr></tbody></table>

マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

こんにちは、エナです。私たちの研究室では、日常的に遺伝子発現プロファイリングを行っています。この手法を用いて、methと野生型の間で差次的に発現調節されている遺伝子をモニターしています。本日は野生型とmethのRNAサンプルを用意しており、まずcDNA合成を行います。間接標識法を用いることで、直接標識で起こり得る観察者の主観によるバイアス（アイバイアス）を防ぐことができます。そのために、RNAサンプルを用意し、全量13 µLの中に3 µgのRNAを回収します。そして、ランダムヘキサマーを2.5 µg添加します。サンプルを75℃で8分間インキュベートし、RNAを変性させます。次に、AM L-D-L-D-U-T-P 混合液、逆転写酵素バッファー、および逆転写酵素を含む逆転写カクテルを添加し、タッピングして混ぜ合わせます。その後、サンプルを42℃で4時間インキュベートします。4時間後、サンプルを取り出します。現在、チューブ内にはcDNAとRNAの混合物があります。次に、水酸化ナトリウムとEDTAを添加してRNAをアルカリ加水分解します。水酸化ナトリウムの最終濃度は100 mM、EB緩衝液の最終濃度は5 mMとしてください。次に、サンプルを65 °Cのウォーターバスで10分間インキュベートします。インキュベーションが完了しましたので、pH 7のHEPES緩衝液を最終濃度500 mMになるように添加し、サンプルを回収します。この時点でサンプルを-20 °Cで保存するか、そのままクリーンアップ工程に進むことができます。cDNAの精製には、KaiGen PCR purification kitを使用します。ただし、Bush bufferおよびion bufferにはfreeingが含まれているため、自前でphosphate wash bufferとphosphate ion bufferを調製します。PPIを300 µL加え、それをゆっくりとピペッティングします。その後、混合液をカラムに移し、最高速度で1分間遠心分離します。次に、調製したphosphate wash bufferを750 µL加え、再度1分間遠心分離します。念のため、もう一度遠心分離を行い、すべてのBedを回収します。その後、これらのチューブの内容物を空のエペンドルフチューブに移します。そして、pH 8.5の4 Mリン酸カリウムである、30 µLのphosphate E bufferを加えます。ここで、すべてをカラムの中央に加えるように注意し、室温で1分間インキュベートします。再び1分間遠心分離を行い、さらに30 µLのzero bufferを加えて室温でインキュベートします。その後カラムを取り出すと、合計60 µLのCDAが得られます。cDNAの精製後、-20°Cで保存するか、あるいは真空凍結乾燥させて保存することが可能です。したがって、ここではcDNAを真空凍結乾燥させています。現在、チューブ内には修飾された乾燥状態のcDNAが入っています。これから、この乾燥サンプルを再懸濁させます。サンプルをpH 9の15 $\mu$L 重炭酸塩溶液に懸濁します。この工程では、ピペッティングを繰り返して行うだけで十分です。cDNAを十分に再懸濁させることが非常に重要です。結合反応を適切に機能させるため、蛍光ラベルは光に敏感であることから、この反応は暗室で行う必要があります。しかし、これらはライフサイエンス社製を選択しており、個別のパッケージに入っています。S5は紫色のキャップ、S3はオレンジ色のキャップをしています。また、懸濁した際、S5はシアン色に、Caryはマゼンタ色に見えます。そのため、暗室において、これらのサンプルを染色チューブに移し、染料を再懸濁させてから、元のチューブに戻します。その後、暗所で2時間インキュベートします。2時間のインキュベーション後、pH 5.2の100 mM酢酸ナトリウムを35 µL添加して反応を停止させます。その後、同様の精製手順でクリーンアップを行います。ただし、今回はQiagen社提供の洗浄バッファーおよび溶出バッファーを使用します。サンプルの注入箇所について説明しますが、その前に器具の洗浄を行う必要があります。それでは、サンプルまたはブレンドを用意してください。こちらはscifiでラベル付けされたサンプルで、ここで確認できるOD 260はCDA含有量を、OD 650はscifiのD取り込み量を示しています。そして、こちらがside 3でラベル付けされたサンプルです。再度、6つの濃度と5つの50測定部位に3回導入します。D社製装置が効率的に動作するため、ここでサンプルを混合し、短時間攪拌します。次に、フィードバックを用いて再度サンプルを記入します。それでは、スライドの処理についてですが、まずスライドを水の上に浮かべて再水和させ、スポットを大きくします。その後、100 °Cで急速乾燥させて固定し、UVハイブリダイズまたはUVクロスリンクによってスポットをスライドに固定します。次に、用意したハイブリダイゼーション前バッファー中でインキュベートします。ここで、スライドを伏せて置きますが、まだ水には触れさせないようにします。そのまま5分間待ちます。このように、ボックスがより大きく見え、投入前よりも光沢が増しているはずです。次に、スライドを100°Cで乾燥させ、結露がないか確認します。そして、youiを用いて架橋を行います。次に、水和を行うため、スライドをあらかじめ温めておいた水に浸します。ここでは、スポットに結合していないすべてのオリゴヌクレオチドを除去することが目的であるため、この操作は迅速に行う必要があります。この工程に時間をかけすぎると、スポットに彗星のような裾を引く「コメットテール」が生じてしまいます。迅速に行うよう注意し、スライドを水から上げないようにしてください。この操作を30秒間行い、すぐに室温で5分間、700 rpmで遠心分離します。次に、このスライドをあらかじめ用意したパイピングステーションバッファーに入れ、ゆっくりとスライドをジャーの中に押し込み、42 °Cで少なくとも45分間インキュベートします。ここでは、ハイブリダイゼーションを行うための乾燥試料があります。まず、これを水で再懸濁させます。このステップでは、ピペッティングで懸濁させます。この際、サンプルを過度に曝露させないようにしてください。次に、10 mg/mL 濃度の精子DNAを 1.5 µL 添加します。そして、1.2 µM の tRNA を添加します。濃度は12.5 mg/mLとし、非特異的なハイブリダイゼーションをブロックするためにtRNAと精子DNAを添加します。次に、最終濃度が3×となるように5.35 µLのMarker 03 10×SSCを添加します。最後に、1% SDSを3.5 µL添加します。次に、混合物を5分間沸騰させ、最高速度で5分間遠心分離すれば、準備が整います。スライドのインキュベーションから1時間が経過し、現在は水とイソプロパノールを用意しています。まず、スライドを水で撹拌してSDSを除去し、次にイソプロパノールで洗浄した後、そのまま標準ゲージに入れます。ここで、乾燥を防ぐために、ライトを空気にさらしすぎないよう注意してください。そのため、私はHarmStationバッファーから直接水へと移し、スライドを洗浄します。数分間洗浄しますが、動作は必ず上下方向のみとし、横方向には動かさないようにしてください。また、スライドが液面から出ないように注意し、すぐにイソプロパノールに移します。そのまま数分間静置してください。その後、室温で5分間静置してください。700 R.Cool. これでスライドのハイブリダイゼーション準備が整いました。埃から保護するため、スライドボックスに入れて保管することをお勧めします。ハーベストステーションでは、リフトまたはスリップを使用します。カバーガラスには白いストリップが付いており、これによりカバーガラスとスライドの間にサンプルを挿入するためのわずかな隙間（リフト）が確保されます。これをエタノールで洗浄し、ゴミなどの粒子が付着していないことを確認します。まず、プリントエリアがマークされたテンプレートスライドを用意し、その上に準備したスライドを重ねて、完全に位置が合っていることを確認します。完全に一致していることを確認してください。また、ストリップが側面にあること、そしてそれを下向きにする必要があることを確認してください。非常に見えにくいですが、視認できることを確認してください。ストライプはスライドの両端にある必要があります。サンプルは両端からロードします。少量のサンプルを使用するため、まず 15 µL を取り、カバーガラスのコーナーからロードし始めます。そして、ゆっくりと引き込みながら、端に沿って動かして全領域をカバーします。この段階では、気泡を混入させないことが非常に重要です。さらに別の15 µLのmigratorをスライドの側面に塗布し、乾燥を防ぎます。これでサンプルの準備が整いました。スライドをインキュベートしますが、ハイブリダイゼーション中にスライドを湿潤状態に保つためのマイクロチャネルを備えたprioritization chamberを使用します。そして、3X SSCを10µLずつ、スライドの6か所に滴下します。チャンバー上の6か所、つまり各コーナーと各側面に滴下してください。カバーガラスがずれないよう、スライドを非常に慎重に移動させてください。スライドを正立させると、あらかじめ滴下した水に密着します。その後、カバーをかけ、ネジがしっかり締まっていることを確認してください。コンバージョンチャンバーを65 °Cの水バッグ内でインキュベートしますが、底面に直接置くことは避けます。そのため、過剰な熱伝達を防ぐためにプラスチック製のバリアを設置します。そこにイオン化チャンバーをそっと配置し、位置がずれないように重りを置いても構いません。このインキュベーションは一晩、通常10〜12時間行います。スライスの洗浄には、0.05% SDSを含む1X SSCを使用します。これはカバーガラスを取り除くための手順です。これが最初の洗浄ステップになります。その後、SDSを除去するために、0.06% six XSCのみを用いてさらに2回のステップを行います。準備が整いましたら、スライドを取り出し、容器の中に裏返して入れます。そのまま左右に振ると、カバーグラスが静かに外れます。次に、XESを含む別の洗浄バッファーに移し、1分間待ちます。06 XSSCで洗浄します。FDSを完全に除去できているか確認するため、この操作をもう一度繰り返します。室温にて700 rpmで5分間遠心分離し、乾燥させます。このスライドは光感受性があるため、スライドボックスに入れて保管してください。こちらはスライドスキャナーです。ここにある小さなスペースに、スライドを裏向きに、ラベルをこちらに向けてセットします。2枚目のスライドでは、スキャンしたい領域を指定します。私たちのスライドでは、この領域を選択します。スライドの作製には16ピンを使用しています。したがって、各ブロックは1つのピンに対応しており、スライドには8,000以上のスポットが含まれています。また、遺伝子数が約4,000であるため、全ゲノムを2回表現しています。つまり、使用するオリゴあたり2つのスポットが存在することになります。さらにズームして見ると、この特定の実験では、転写調節因子の変異体と野生型を比較していることがわかります。変異体には赤色を示すscifiでラベル付けされ、野生型には緑色を示すsite 3でラベル付けされています。したがって、これらのスポットのように赤く見える部分は、変異体における転写物の量が多く、野生型よりも高かったことを示しています。したがって、それらは赤色または赤系の色で表示され、緑色に見えるものは、変異体と比較して野生型でその転写物の量が高かったことを示しています。また、黄色に見えるスポットは、その転写物が変異体と野生型の両方で同等に存在していたことを示しています。つまり、これらが重なり合うと、これらのスポットのように黄色く見えるということです。

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