マイクロアレイを用いた細菌の遺伝子発現解析

こんにちは、私の名前はエナで、私たちは研究室で定期的に遺伝子発現プロファイリングを行っています。そして、この技術を使用して、覚せい剤と野生型との間の差動制御遺伝子を監視しています。そして今日、私は野生型と覚せい剤のRNAサンプルを持っており、私たちは皆、最初にCをやっています。

私たちは間接ラベリング法を使用しており、この手法の利点は、直接ラベリングで発生する可能性のあるアイバイアスを防ぐことです。そのために、RNAサンプルがあり、総体積の13マイクロリットルに3マイクログラムのRNAを取得することを選択します。そして、私たちは公園にランダムなheの2.5マイクロを追加します。

そして、サンプルを75°Cでインキュベートし、RNAの性質に8分間触れます。そして今、私たちは、AM L-D-L-D-U-T-Pコンティニュアスミックス、逆転写酵素バッファー、ET TTを含む逆転写カクテルを追加し、サンプルを42度で4時間インキュベートします。ですから、4時間後にはサンプルを取り出します。

そして今、チューブの中にはCDNAとRNAの混合物があります。そして、私たちがやりたいのは、水酸化ナトリウムとEDTAを添加してヒドロックスRNAを行い、水酸化ナトリウムの最終濃度を100モルにすることです。そして、e BTの最終濃度は5モルであるべきです。

そして今度は、65度のウォーターバスでサンプルを10分間インキュベートします。インキュベーションが完了し、最終濃度の500モルにpH 7ヒープ1の水を加えてサンプルを利用します。この時点で、サンプルをマイナス 20 度で保存するか、クリーンアップを続行できます。

CDNAのクリーンアップには、KaiGen PCR精製キットを使用しています。しかし、ブッシュバッファーとイオンバッファーにはフリーイングが含まれているため、私たちはしません、私たちは独自の運命ブッシュバッファーと運命イオンバッファーを準備し、300リットルのPPIを追加し、その池をゆっくりとパイプでつなぎ、混合物をカラムに移し、最高速度で1分間回転します。 準備したバッファー。リン酸塩洗浄バッファーは、750マイクロリットルなどを追加し、さらに1つ追加します。

だから、すべてのベッドがすべて揃ったことを確認するために、もう一度回転します。そして、これらのチューブを空の違反者チューブに移します。そして、pH 8.5のリン酸カリウムの4モルであるpho phosphate Eバッファーのマーカーを30個追加します。

ここでは、カラムの中央にすべてを追加し、室温で1分間インキュベートすることを確認する必要があります。そこで、再び1分間回転し、インキュベートする30マイクロゼロバッファーまたは寝室にさらに追加します。そこで、カラムを取り外すと、総容量は60マイクロまたはCDAになります。

CDNAをクリーンアップしたら、マイナス20度で保存することができますし、乾燥させてから保存することで、フィードバックでCDNAを乾燥させることができます。そのため、チューブ内には乾燥したCDAがあり、これは修正されています。そして、私たちが行うことは、乾燥サンプルを一時停止することです。

サンプルを 10 LAR 重炭酸塩 15 枚で pH 9 で懸濁します。そして、このステップで上下に動かすことでこれを行いますが、cDNAをResusすることは非常に重要です。まあ、企業の反応を仕事に買うためには、蛍光ラベルはダイセンシティブであるため、この反応は暗い部屋で行う必要があります。

しかし、ライフサイエンスからこれらを選択することで、彼らは個々のパッケージで来ました。Sファイブは紫色のキャップ、サイド3はオレンジ色のキャップで、Sファイブは吊り下げられるとシオン、キャリーはマゼンタに見えます。そこで、暗室で行うことは、これらのサンプルを染料チューブに移し、染料を再度懸濁して、手持ちのチューブに戻すことです。

そして、2時間のインキュベーションの後、2時間暗闇でインキュベートします。これらの反応は、pH 5.2で100ミリモルの酢酸ナトリウムを35 re添加して停止します。その後、同様のクリーンアップ手順でクリーンアップを行いました。しかし、今回はケイジャン提供の洗浄バッファーと溶出バッファーを使用しています。

サンプルを置く場所や、装置をクリーニングする場所を説明できます。だから、あなたはあなたのサンプルやあなたのブレンドをすることができます今私はに、だからこれは私のscifiラベルのサンプルであり、ここで私たちが見るのは、CDAの含有量とscifiのDの組み込みを示すOD 6 50、OD 2 60です。そして、これが私のサイド3ラベルのサンプルです。

再び、ねじれ6集中と550はサイト3の組み込みを測定します。私のDコーポレーションは効率的に働いているので、サンプルを組み合わせます さて、Ms.Miss itを簡単に。そして、フィードバックを使用してサンプルを再度作成します。

さて、スライドの化のために、スライドを水の上に普遍的に置くことで水分を補給し、スポットを大きくします。そして、それを保護するために、摂氏100度でスナップドライし、スポットをスライドにUVハイブリダイズまたはUVクロスリンクし、次に、手持ちのプレハイバッファーでインキュベートします。そこで、滑り台を下向きに置きますが、まだ水に触れていません。

そして、私たちはこのように5分間待ちます。I、だから、この箱は大きく見え、置く前よりも光沢があるはずです、そしてあなたはちょうどスライドを百度に置くことによってスナップ乾燥するでしょう、そしてあなたは結露を観察するでしょう。そして、youiとクロスリンクします。

だから水分補給のために、私はちょうど戦前の水に滑り台を浸す。そして、これは本当に速いはずです、なぜなら、ここでの目的は、リンクされていないスポット上のすべてのスポットまたはすべてのオリゴを取り除きたいということです。そして、このプロセスをゆっくり進めると、その場でコムテールが発生するだけです。

だから、あなたが本当にそれを速くやっていることを確認し、あなたが水からあなたのフライトを取らないことを確認し、30秒間、ちょうど5分間と700空気pmの室温ですぐにfutしてくださいこれを手に入れ、私たちはこのスライドを戦前のパイプステーションのバッファーに合わせます 私たちは持っていた そしてゆっくりとスライドを瓶に押し込み、これを42度でインキュベートします少なくとも45分。そこで、ここにはハイブリダイズする乾燥サンプルがあります。そこで、まずResusを水中に浮遊させます。

このステップでは、上下に起こることによってサスペンドを復活させ、サンプルを白く、白く露出させないようにすることができます。そして、誰かの精子DNA1.5を追加し、濃度は10ミリグラム/ミルです。そして、TRNAの1.2マーケターを追加します。

濃度は12.5ミリグラムあたりで、tRNAと精子DNAを添加して非特異的なハイドロをブロックします。そして、5.35マーカーゼロ3XSSCを追加すると、最終濃度は3xになります。そして最後に、3.5マイクロリットルの1%SDSを追加します。

次に、混合物を5分間沸騰させ、最高速度で5分間回転させ、それを行う準備が整います。スライドをインキュベートしてから1時間が経ち、今は水とイソプロパノールがあります。そこで、まずスライドを水で攪拌してSDSを取り除き、次にdzaプロパノールを洗って直接標準ゲージに入れます。

また、ここでは、乾燥を防ぐために、光を空気にさらしすぎないように注意してください。だから私は直接害ステーションの緩衝材から水に行き、スライドを洗います。数分後、動きが横ではなく上下だけであることを確認してください。

また、スライドが水面上にないことを確認して、すぐにイソプロパノールに移します。そして、それは再び数分間ここにとどまります。そして、あなたのページは室温で5分間あなたのページに答えてください。

700 R.クール。したがって、私たちのスライドもハイブリッド化する準備ができており、バスから保護するためにスライドボックスに保管しておくとよいでしょう。したがって、収穫ステーションでは、リフトまたはスリップを使用します。

カバースリップには白い帯があり、それらはいくらかのリフトを提供し、サンプルがカバースリップとスライドの間に入るためのスペースを提供します。そして、エタノールでそれをきれいにし、ワイヤーを下ろして、テスト粒子がないことを確認します。したがって、最初に、印刷領域がマークされたテンプレートスライドを取り、その上に準備したスライドを配置して、それらが完全に整列していることを確認します。

それらが完全に揃っていることを確認してください。そして、ストリップが側面にあること、私たちがそれを下に向けることを確かめる必要があります。ですから、本当に見づらいですが、見えるようにしておきましょう。

また、ストライプはスライドの側面にある必要があります。そして、側面からサンプルをロードします。少量のサンプルを採取するので、まず15マイクロリットルを採取し、カバースリップの角からロードを開始します。

そしてゆっくりと引き込み、端に沿って移動してすべての領域をカバーします。この段階では、気泡を導入しないことが非常に重要であり、私は別の15マイグレーターを取り、乾燥を防ぐためにスライドの側面に適用します。サンプルの準備ができたので、スライドと優先順位付けチャンバーをインキュベートします。これは、ハイブリダイジング中にスライドを水和するためのマイクロチャネルを備えています。

また、スライドの 6 つのコーナーに 3 つの XSSC の 10 人のマーケターを追加します。には6つの場所がありました、チャンバーには、申し訳ありませんが、各コーナーに、そして両側に、カバースリップが滑り落ちないようにスライドを本当に優しく移すことを確認してください。そして、スライドを右側を上にして置くと、積み重ねられ、置いた水にくっついてカバーを取り付け、ネジがしっかりと締まっているのがわかります。

会話チャンバーは65度のウォーターバッグでインキュベートしますが、底に直接置くのは避けます。そこで、過剰な熱伝達を防ぐために、ある種のプラスチックバリアを配置しました。また、イゼーションチャンバーをやさしく配置し、ずれを防ぐために、ある種の重りを置くこともできます。

そして、このインキュベーションは一晩中、通常は10時間から12時間続きます。そのため、スライスの洗浄には、0.05%のSDSを持つXSSCを1つ使用します。これは、カバースリップを取り外すためのものです。

そして、これは最初のステップを洗うためのものになります。また、0.06%six XSC を使用して、すべての SDS を使用してさらに 2 つの手順を実行します。だから、みんなで会話をねじ込み、スライドを取って、それを裏向きにして財布の容器に入れます。

そして、それを左右に振るだけで、カバースリップが優しく落ちるのがわかります。では、XESを含む他の洗浄バッファーに移し替えます。あなたは1分間食べます。

OH 6 XSSCに移行する。そして、すべてのFDSを確実に取り除くために、もう一度繰り返します。遠心分離機を乾燥させ、室温で 5 分間、700 RP で乾燥させました。このスライドは光に敏感であるため、スライドボックスに入れておきます。

だから、これはスライドスキャナーで、ここにスライドを入れます、ここに小さなスペースを入れます、スライドを下向きにして、に向かってラベルを付け、そして、2番目のスライドでは、スキャンしたい領域を定義するだけです。そして、あなたはただ私たちのスライドでこの領域を取るでしょう。私たちは、スライドを印刷するために16本のピンを使用しています。

そのため、各ブロックは 1 つのピンに対応しており、スライドには 8 、 000 以上のスポットが含まれています。そして、viカラーゲノムは、約4, 000遺伝子であるため、2回表しています。そのため、使用するオリゴごとに2つのスポットがあります。

そして、これらを拡大すると、この特定の実験では、転写調節因子の変異体を野生型と比較し、変異体をscifiでラベル付けして赤色にすることがわかります。そして野生型はサイト3で、緑色をしています。ですから、これらの斑点のように赤く見えるものは、突然変異体の転写産物の存在量が野生型よりも多かったことを示しています。

そのため、赤または赤の色合いで表示され、緑色に見えるものはすべて、転写産物の存在量が突然変異体と比較して野生型の方が多かったことを示しています。そして、黄色に見える斑点は、その転写産物が突然変異型と野生型の両方に等しく存在していたことを示しています。そのため、オーバーレイすると、これらのbutのように黄色で表示されます。