IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

IP FCM実験では、相互作用するさまざまなタンパク質を同定および研究するために、タンパク質複合体をビーズに捕捉します。まず、目的のタンパク質に特異的な免疫沈降抗体がポリスチレンラテックスビーズと共有結合しています。第2のステップとして、これらのビーズを細胞溶解物とインキュベートし、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をビーズに結合させます。

ビーズを捕捉されたタンパク質と一緒に、次いで、免疫沈降タンパク質に結合し得る種々の分子に特異的な蛍光標識抗体で洗浄し、プローブする。最後に、蛍光標識されたビーズをフローサイトメトリーで分析し、捕捉された複合体に存在しないタンパク質がどのタンパク質に存在するかを判断します。この手法は、免疫沈降法やウェスタンブロッティングなどの他の方法よりも優れている点として、I-P-F-C-Mが遺伝子工学や大きなサンプルサイズを必要とせずに、天然タンパク質タンパク質の相互作用を評価できることです。

I-P-F-C-Mは、少量で低濃度の分析物で実施できるため、分析に利用できる生体材料が非常に少ない場合でも、高いS/N比を得ることができます。この手順を開始するには、次のバッファー、MESカップリング、バッファークエンチングブロッキングストレージバッファー、短縮QBS、フローサイトメトリーまたはFCMバッファーを準備します。カルボン酸変性ポリスチレンラテックスビーズまたはCMLビーズの濃度を測定するには、PBSで希釈し、ヘモサイトメーターでカウントします。

ビーズの濃度が決定されたら、6つのビーズに18×10をピペットで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。室温で3分間、重力20、000倍で遠心分離するMESカップリングバッファーの0.5〜1ミリリットルでビーズを2〜3回洗浄します。ビーズが遠心分離されている間、各洗浄後。

ビーズの活性化に使用するための新しいe dac MESバッファーを準備します。洗浄が完了したら、バッファーを室温または氷上に保ちます。最終洗浄後、ビーズを50マイクロリットルのMESカップリングバッファーに再懸濁します。

次に、ビーズ懸濁液に20マイクロリットルのEEC MESを追加します。ビーズ上のカルボキシル基を活性化するためには、手動で15分間連続してピペッティングし、室温で穏やかに混合します。このステップは労働集約的ですが、この混合方法は、混合後に最良の結果をもたらします。

活性化ビーズを 0.5 〜 1 ミリリットルの PBS Centrifusion で 20 、 000 回洗浄します。室温で3分間の重力 最終洗浄後の各洗浄後、活性化ビーズを50マイクロリットルのPBSに再懸濁して、IP抗体をビーズに結合させます。1ミリリットルあたり0.2〜1ミリグラムのストック濃度から50マイクロリットルのIPモノクローナル抗体を添加します。

抗体以外の第一級アミンを含む分子が存在しないことを確認してください。トリスやウシ血清アルブミンなどのこれらのアミン含有分子は、ビーズへの結合をめぐって抗体と競合します。ビーズ抗体懸濁液を振動シェーカー上で室温で3〜4時間混合します。

チューブの底にビーズが沈降しないように十分に振ってください。バインディング後。抗体タラビーズを0.5〜1ミリリットルのPBS遠心分離機で20,000回洗浄します。

各洗浄後、室温で3分間重力。最後に、ビーズを100マイクロリットルのQBSバッファーに再懸濁します。モノクローナル抗体とCMLビーズとの結合は、IgGに対するフルーロ標識抗体でビーズを染色することで確認できます。

FCM分析に続いて、モノクローナル抗体でコーティングされたビーズは、IP実験で使用する準備ができるまで摂氏4度で保存できます。まず、ビーズをPBSで1〜200〜10,000に希釈して懸濁し、ヘモサイトメーターでカウントします。各IP実験で使用されるビーズの数を正確に制御できるように、濃度は分取バッチごとに測定する必要があります。

次に、体積あたり2%の重量で水溶液で新鮮な掘りを準備します。摂氏95度に5分間加熱します。その後、氷の上で冷やします。

希釈し、新たに調製した溶解液で1容量あたり1%の重量に掘り下げ、バッファーし、氷上に保管します。lysする細胞の数は、ガイドラインとして示された表を用いて決定します。ただし、必要な細胞の数は目的のタンパク質によって異なり、経験的に決定する必要があります。

ここでは、小さなリンパ球性腫瘍細胞株から6個の細胞を30倍10回使用する。必要な細胞懸濁液量を1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。細胞を20, 000回でペレット

摂氏4度で30秒間重力をかけ、メディアを吸引します。作りたてのものを適量加えます。ピペッティングで上下に穏やかに混合したペレットに溶解バッファーを掘ります。

次に、細胞を氷の上で20分間シラミにさせます。研究対象の細胞タイプやタンパク質タンパク質相互作用によって、細胞溶解条件は異なる可能性があり、溶解が完了したときに経験的に決定する必要があることに注意してください。核と不溶性の細胞の破片を、ライセートを20, 000回遠心分離して除去します。

重力、摂氏4度で10分間。SNAを保持し、ペレットを廃棄して、標的タンパク質を抗体コーティングビーズに結合させます。50, 000 から 250, 000 モノクローナル抗体結合ビーズを清澄化したライセートピペッティングに穏やかに加えます。

1つのIPに使用されるライセートの最小量を混合するには、5マイクロリットルです。清澄化されたライセートとビーズミックスを回転する垂直ホイールに4時間から一晩置くと、ビーズが体積ips以下に沈殿するのを防ぐのに十分な速度に設定された冷蔵室で、回転中に液体がチューブの底に留まることができます。標的タンパク質のIP抗体への結合を追跡します。

免疫複合体の蛍光標識に進みます。FCM緩衝液と呼ばれる1ミリリットルの氷でIPビーズを2回洗浄し、重力20,000倍で摂氏4度で3分間遠心分離します。各洗浄後、ビーズを100マイクロリットルのFCMバッファーに再懸濁し、20マイクロリットルを5つ以上のそれぞれに分注します。

1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管または煙突底板の井戸。ここでは、両方を示します。蛍光色素標識モノクローナル抗体をサンプルに添加します。

FCM染色は、ベンダーの指示に従って、または経験的に決定された濃度を出発点として実施します。チューブまたはウェルあたり少なくとも0.1ミリグラム/ミリリットルの0.2から1マイクロリットルのストック抗体溶液を添加し、氷上で40分間インキュベートします。プローブしたビーズを1.5ミリリットルのチューブに入れ、1ミリリットルの氷冷で2回洗浄します。

FCM バッファー、 20 、 000 回で遠心分離します。重力を摂氏4度で3分間。毎回の洗浄後、ビーズを乱さないように注意しながら、各洗浄後にスペイネートをそっと取り出します。

あるいは、煙突の場合、底板は0.2ミリリットルの氷冷で2回洗浄し、FCMバッファーを摂氏4度で5分間重力1000倍で遠心分離します。各洗浄後、各洗浄後。ビーズから上清を取り除くには、プレートを一度フリックしてから、逆さまにしたまま、ウェルの端からの滴りを拭き取ります。

ビーズを含む各ウェルの残留容量は約20マイクロリットルになります。ラベル付きファックス管へのサンプル移送ごとに、ビーズを200マイクロリットルのFCMバッファーに懸濁します。これで、サンプルはBecton DickensおよびフローサイトメーターでのフローサイトメトリーまたはFCMの準備が整いました。

サンプルインレットまたはシップを囲む可能性のある液滴封じ込めスリーブを取り外します。サンプル間で一口を滴下させると、ビーズが1つのサンプルから別のサンプルに持ち越されるのを防ぐことができます。ここで用いるCMLビーズの直径は3〜5マイクロメートルで、静止状態のマウスリンパ球の直径の約半分です。

したがって、ビードイベントのポピュレーションのために、前方散乱アンペアのゲインと側面散乱電圧を手動で増加させる必要がある場合があります。ここでサイトメーターに登録するには、ラベルなしまたはブランクビーズを使用して登録します。歩行の設定は、読み取り前にビーズ、ダブレット、およびアブリを除外するように調整されます。

実験サンプルにより、蛍光がスケール通りになることが保証されます。標識されていないビーズは蛍光のネガティブコントロールとして機能し、レインボーキャリブレーション粒子またはRCPは蛍光のポジティブコントロールとして使用できます。RCPはCMLビーズよりも小さいため、そのサンプルの前方散乱と側方散乱のパラメータ、および歩行位置を一時的に変更する必要がある場合があります。

これらのキャリブレーション後、ネガティブ蛍光とポジティブ蛍光の極値が対数軸上に可視化されます。RCPによるキャリブレーションが完了したら、前方散乱光と側方散乱光のラベルなしビーズ設定に戻ります。ここに示す実験のように、サンプルごとに1つの蛍光プローブのみを使用する限り、蛍光補正は必要ありません。

蛍光データファイルの取得と保存、解析は、cell QuestやFlowJoなどのフローサイトメトリーソフトウェアを使用して行われます。マウスT細胞LYを1%digit toinでIP FCM解析した結果を示します。TCR CD 3非タンパク質複合体を抗CD 3イプシロンビーズで引き下げた。

捕捉された複合体には、TCRベータおよび共結合CDの3つのイプシロンが大量に含まれています。他のタンパク質のバックグラウンドレベルに近いものは、無関係な免疫グロブリンプローブまたはタンパク質TH 1.2、CD 45、またはH two KDに対する抗体を使用して決定されたように検出されました。この手法は、免疫沈降法やウェスタンブロッティングなどの他の方法よりも優れている点として、I-P-F-C-Mが遺伝子工学や大きなサンプルサイズを必要とせずに、ネイティブタンパク質タンパク質の相互作用を評価できることです。I-P-F-C-Mは、少量で低濃度の分析物で実施できるため、分析に利用できる生体材料が非常に少ない場合でも、高いS/N比を得ることができます。