Name: IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学ぶIP-FCM法によるタンパク質複合体の検出。抗体結合ビーズで免疫沈降し、フローサイトメトリーで相互作用を解析。少量サンプルで高感度にタンパク質間相互作用を評価できる革新的な生化学的手法です。

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天然のタンパク質-タンパク質相互作用およびフローサイトメトリーによる多タンパク質複合体の高感度検出と定量分析：**このビデオプロトコルは、関連する出版物1に基づいています 。アダムG. Schrum、ダイアナギル、エレインP.ドップァー、デビッドL.ウィースト、ローレンスA.ツルカ、ヴォルフガングWA Schamel、エドパーマー。科学のSTKE 2007（389）：PL2 2007年6月5日、[DOI：10.1126/stke.3892007pl2]。 <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">この文書を見るにはここをクリックしてください</a> 。 起動する前に、次の水性ストック溶液を準備します。 <table><tbody><tr><td> MESカップリングバッファ： </td><td> 25℃で保存 </td></tr><tr><td> MES、pH6.0の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td> / /ストレージ（QBS）ブロッキングバッファー消光： </td><td> 4℃で </td></tr><tr><td> BSA </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td> 0.02パーセント</td></tr><tr><td> PBS、pH7.4の</td><td> 1X </td></tr><tr><td> FCMバッファー： </td><td> 4℃で </td></tr><tr><td>トリス、pH7.4の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 100mMの</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td> 0.02パーセント</td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5パーセント</td></tr><tr><td> PBS、pH7.4の</td><td> 1X </td></tr></tbody></table>すぐに使用する前の準備： <table><tbody><tr><td> EDAC - MES： </td><td> MESカップリングバッファーで50 mg / mLのEDACの粉を溶かし</td></tr><tr><td> ジギトニン溶液（2％w / v）の： </td><td> 95に加熱することによってのdH 2 Oでジギトニンの粉を溶かし℃で5分間、氷上に冷却</td></tr><tr><td> 溶解バッファー： </td><td></td></tr><tr><td>トリス、pH7.4の</td><td> 50mMの</td></tr><tr><td> NaClの</td><td> 150 mmの</td></tr><tr><td>ジギトニンのソリューション</td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td> 1X </td></tr><tr><td> 氷上に置きます </td><td></td></tr></tbody></table> 1。ビーズに抗体のカップリング<ol><li> PBSで希釈し、血球計でカウントすることにより、購入した株式からビーズの濃度を決定する。カウントのためのビーズの1:10000希釈で始まります。 </li><li>ピペット18 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに× 10 6ビーズ。 </li><li>各洗浄後25℃で3分間、20,000 G · Cで遠心分離、0.5〜1.0mLのMESのカップリングバッファーでビーズを2〜3回洗浄する。 </li><li> 50μLMESのカップリングバッファーでビーズを再懸濁します。 </li><li>作りたてのEDAC - MESの20μLを加えることにより、ビーズ上のカルボキシル基を活性化する。 </li><li> 25℃を手動ピペッティングで15分間穏やかに混合する。 </li><li> 25℃で3分間、20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後、0.5〜1.0mLのPBS中で活性化ビーズを2〜3回洗浄する。 </li><li> 50μLのPBSで活性化ビーズを再懸濁します。 </li><li>活性化ビーズソリューションにIPモノクローナル抗体（0.2〜1.0 mg / mLの原液濃度で）を50μLを加える。 </li><li>振動シェーカーにチューブを配置することにより25℃で3〜4時間のミックス。チューブの底にビーズの沈降を防止するために十分にシェイク。 </li><li>ウォッシュ抗体結合ビーズは0.5〜1.0mLのPBSで2〜3倍は、各洗浄後25℃で3分間、20,000 gで° C遠心分離。 </li><li> 100μLQBSバッファーでビーズを再懸濁します。これらは、4℃で保存することができます</li><li>ビーズを一時停止するだけでなく、PBSで1:200-1:10,000を希釈し、血球計でカウント。濃度は、それぞれのIPまたは、プルダウン実験に使用したビーズの数を正確に制御できるように、各分取バッチを測定する必要があります。 </li></ol> 2。ポスト核ライセートの調製とIP 溶解法と最適な溶解条件は、細胞の種類や検査中のタンパク質 - タンパク質相互作用に依存します。多数のプロトコルが存在し、アプリケーションに変更することができます。 <ol><li>氷上で20分を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに100μLの新鮮な溶解バッファーで、そのようなリンパ球、または5のような20 × 10 6'small'は細胞を、このようなマクロファージや腫瘍細胞など× 10 6'大'細胞を、溶解する。必要に応じて溶解量を拡大縮小します。 </li><li>核と不溶性の細胞残渣を除去するために、4℃で10分間、20,000 gでライセートを遠心上清をキープし、ペレットを捨てる。 </li><li>ミックスに軽くピペッティング0.5 × 10清澄溶解液5〜2.5 × 10 5抗体結合ビーズを追加します。我々の目的で使用する最小量単一のIPを実行するには、5μLです。 </li><li>寒い部屋で一晩に垂直な回転する車輪の上に置いて4時間。セトリングからビーズを防ぐのに十分な速度に設定します。それは、回転中にチューブの底に残っている少量のIPの液体に対して許容可能である。 </li></ol> 3。蛍光標識抗体とビーズに捕捉されたタンパク質のプロービング<ol><li> 4で20,000 gで遠心分離° Cを各洗浄後に3分間、0.2〜1.0mLの氷冷FCMバッファーのIPビーズを2回洗浄する。 </li><li>五人以上、1.5 mLのマイクロ遠心チューブまたは煙突、底板の各ウエルに100μLのFCMバッファー、アリコート20μlにビーズを再懸濁します。 </li><li>サンプルに蛍光色素標識モノクローナル抗体を追加。 FCMは、ベンダーの指示に従ってまたは経験的に決定した濃度に応じて染色行います。出発点として、チューブごと、またはよく株式の抗体溶液の0.2〜1μLを（0.2〜1.0 mg / mLの時）に追加し、氷上で40分間インキュベートする。 </li><li>ウォッシュは4で20,000 gで遠心分離、1.0 mlの氷冷したFCMバッファーに1.5 mlチューブに2回ビーズをプローブ·各洗浄後の3分間。優しくビーズを乱さないように注意しながら、それぞれの洗浄の後に上清を取り除く。煙突底板の場合は、4℃で5分間千グラムで遠心分離、0.2mLの氷冷FCMバッファーで2回洗浄° Cを各洗浄後。マルチチャンネルピペッターは、このステップに便利です。煙突の底板にビーズから上清を除去するには、"フリック"プレートは一度、その後、まだ逆さにしながら、井戸の端から任意のしずくを汚点。各ウェル内の残留量は、ビーズを含む、約20μLになります。 </li><li>サンプルあたり200μLのFCMバッファーでビーズを再懸濁します。というラベルのFACSチューブに移す。現在、サンプルFCMのための準備が整いました。 </li></ol> 4。 FCM取得このプロトコルで説明されているCMLのビーズは、直径3〜5μmの、静止マウスのリンパ球の約半分の直径です。そのため、手動でスケールを登録するためにビーズのイベントの集団のために前方散乱光（FSC）アンプゲインと側方散乱光（SSC）の電圧を増加させる必要があるかもしれません。個々のIPのビーズは、単一のしっかりとクラスタ化された人口を形成すべきである。設定とゲートがビーズダブレットと破片を除外するように調整する必要があります。 <ol><li>ビーズやビーズの基準を実行する前に、いくつかのメーターに試料導入口を囲む滴封じ込めのスリーブを取り外します。これは入口をクリアし、別のサンプルから引き継がれてからビーズを防止するようにシース液は、サンプル間に滴下することができます。 </li><li>両方否定的と肯定的な蛍光が極端に対数x軸で同時に表示されるように設定を調整するためにラベルのないビーズ、蛍光のネガティブコントロール、そして虹のキャリブレーション粒子（RCPs）、蛍光の陽性コントロールを、使用してください。これは、実験試料からの蛍光は、また規模になることが保証されます。 FSCとSSCのパラメータは、そう、RCPsはCMLのビーズよりも小さいことに注意して、同様にゲートの位置、一時的にそのサンプルのため変更する必要があるかもしれません。 </li><li> RCPsとキャリブレーションが完了すると、ラベルの付いていないビーズの設定に戻ります。サンプルごとに1つの蛍光プローブが使用されている場合、蛍光補正は必要ありません。一般的に、我々は、FCMのサンプルごとに単一の蛍光色素標識モノクローナル抗体を持つ多タンパク質複合体の検出を行ない、我々は、様々なサブユニットの特異的mAbでパラレルビーズ試料を染色することによって、複数の相互作用パートナーを調べる。 </li><li>蛍光データファイルを取得して保存。分析は、フローサイトメトリーのようなCellQuest、FlowJoなどのソフトウェア、またはCFlowを使用して実行することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。マウス系統BALB / cからTCR/CD3多タンパク質複合体のためのIP - FCM。T細胞は1％ジギトニンで溶解し、ライセートを抗CD3εのビーズを使用してIP - FCMを行った。キャプチャされた複合体は、TCR -β（紫の領域）の有意な量を含んでおり、共同で関連したCD3 -ε（緑）、それに近いバックグラウンドレベルに（無関係の免疫グロブリンのプローブ、ピンクのトレースによって定義される）などThy1.2のような他のタンパク質のCD45、またはH - 2K（D）（茶色、オレンジ、そして青のトレース、それぞれ）。同様の以前に公表された結果1-6を参照してください。

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

タンパク質 - タンパク質相互作用に関する情報は、このようなシグナル伝達、系統の成熟、細胞周期の進行、およびアポトーシスのカスケードのような多くの細胞プロセスの分析との関連性が高いです。 IP - FCMは、タンパク質の相互作用を調べたり、その本来のコンフォメーションで多タンパク質複合体のメンバーを定義するために、迅速な定量的、かつ高感度な方法を提供します。ビーズが結合し、細胞溶解物と共にインキュベートした一日にしてプローブと次の日に分析することができますすることができます。 96ウェルプレートフォーマットでは、統計的またはスクリーニングpurposesのために効率的なデータ収集を提供するために、一度に分析するサンプルの大規模な数値を可能にする。蛍光ビーズの基準を使用して、それぞれのビーズによって捕捉されたタンパク質の数を推定することができる。非常に小さなソースの材料は、捕捉および検出のために必要ですので、限られたサンプルと希少な検体は、依然として、複数の相互作用を分析することができます。 IP - FCMは、非生理的環境でのタンパク質の遺伝子工学、エピトープタギング、変性、またはインビトロでのミキシングを必要としないが、それはそれへの適用性を持つ貴重なとアクセス可能なツールとなって、これらと他の技術と組み合わせて使用することができます多くの生物学的システム。 トラブルシューティング： 多くのIP - FCMの実験では、有用なタンパク質相互作用のデータに彼らが試みている初めてを生成します。しかし、IP - FCMの最適化は、ビーズ、タンパク質複合体のキャプチャ、および結合性蛍光プローブに抗体結合を向上させることができます。 IP抗体結合の効率は、抗免疫グロブリン抗体と直接結合したビーズをプローブによって決定することができる。この効率性が低い場合は、カップリング反応時の抗体の濃度を増加させるとより多くのIP抗体は、それぞれのビーズに接続できるようにすることができます。これは、分析対象物の拡張された捕捉および検出の結果、IPビーズバッチの結合容量を増やすことができます。これらはビーズ添付ファイルと低い抗体の結合の結果のモノクローナル抗体と競合できるように他の主要なアミン含有分子（例えば、トリス、ウシ血清アルブミン）は、カップリング反応の間に存在すべきではない。ビーズへの抗体の結合は、他の理由から問題が判明した場合、ビーズの代わりにアビジン/ストレプトアビジンに結合することができ、そしてビオチン化抗体は、その後に非共有結合とimmunprecipitationに使用することができます。 良い抗体結合にもかかわらず、ビーズ関連蛍光の最初の検出は、低い可能性があります。最初に、複雑なキャプチャ自体は低いかもしれない。 IP - FCMは、ユニットの溶解体積あたりの溶解した細胞の数を増やし、検体の濃度に依存するため、分析物捕捉および検出を向上させることができます。さらに、キャプチャは、キャプチャが少ないビーズ間の複合体、およびプローブビーズ当たりの増加の平均蛍光の結果を配布ライセート、とインキュベートIPビーズの数を減らすことで改善されることがあります。第二に、それは、キャプチャされた複合体へのプローブの抗体のアクセスが立体的に免疫沈降抗体によって阻害されている可能性があります。この場合、問題は、および/またはプローブをキャプチャする別の抗体を使用して対処することができます。

<table><tbody><tr><td>カルボキシ基修飾ポリスチレンラテックス（CML）ビーズ (5mm界面活性剤フリー)</td><td>試薬</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>4&amp;#x00B0;Cで保存すること。</td></tr><tr><td>レインボー校正用粒子</td><td>試薬</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>4&amp;#x00B0;Cで保存すること。</td></tr><tr><td>2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸 (MES)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (EDAC)</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>デシケーター内で-20&amp;#x00B0;Cで保存すること。</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤汎用カクテル（AEBSF、ベスタチン、アプロチニン、EDTA、E-64、およびロイペプチンを含む）</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Oで100倍ストック溶液を調製する。分注し、-20&amp;#x00B0;Cで保存すること。手袋を着用して取り扱うこと。</td></tr><tr><td>PCRプレート、96ウェル 0.2mL、ナチュラル、ハイチムニー</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>FCM染色の際、マイクロ遠心チューブの代わりに使用する</td></tr></tbody></table>

ip - fcm：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

フローサイトメトリー（IP - FCM）によって検出された免疫沈降はタンパク質 - タンパク質相互作用を検出および定量するための効率的な方法です。基本的な原理は、キャプチャされた主な分析対象物が物理的に多タンパク質複合体の中で関連する他の分子と一緒に検出できる特徴と、サンドイッチELISAのことを拡張します。手順は、細胞ライセートでこれらのビーズをインキュベート蛍光標識プローブで捕捉タンパク質複合体をプロービングし、フローサイトメトリーによってビーズに関連した蛍光を分析する、目的のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（mAb）を免疫沈降したポリスチレンラテックスビーズの共有結合を含む。 IP - FCMは、非常に敏感であり、そのネイティブ（非変性）状態でのタンパク質の解析を可能にし、どちらかの半定量的または定量分析に適している。追加の利点として、IP - FCMは、フローサイトメーター以外の遺伝子工学や特殊な機器を、必要としない、そしてそれは容易に高スループットのアプリケーションに適合させることができる。

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 - タンパク質相互作用の敏感な、堅牢な、生化学的評価を可能にする、提示される。

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

フローサイトメトリー検出免疫沈降法（IP-FCM）は、タンパク質間相互作用を検出し定量するための効率的な手法です。基本的な...

IP FCM実験では、相互作用するさまざまなタンパク質を同定し研究するために、タンパク質複合体をビーズ上に捕捉します。まず、目的のタンパク質に特異的な免疫沈降抗体をポリスチレンラテックスビーズに共有結合させます。次に、これらのビーズを細胞溶解液とともにインキュベートし、特異的タンパク質および相互作用タンパク質をビーズに結合させます。ビーズと捕捉されたタンパク質を回収し、洗浄した後、免疫沈殿したタンパク質に結合している可能性のある様々な分子に特異的な蛍光標識抗体でプローブします。最後に、蛍光標識されたビーズをフローサイトメトリーで分析し、どのタンパク質が捕捉された複合体内に存在し、あるいは欠落しているかを判定します。免疫沈殿後にウェスタンブロッティングを行うなどの他の手法に対するIP-FCMの利点は、遺伝子工学的な操作や大量のサンプルを必要とせずに、ネイティブなタンパク質間相互作用を評価できることです。I-P-F-C-Mは、微量なボリュームおよび低濃度の分析物で実施可能であるため、分析に使用できるバイオマテリアルが極めて少ない場合でも高いSN比を得ることができます。この手順を開始する前に、MESカップリングバッファー、クエンチ・ブロッキング保存バッファー（略称：QBS）、およびフローサイトメトリー（FCM）バッファーを調製してください。カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックスビーズ（CMLビーズ）の濃度は、PBSで希釈し、ヘモサイトメーターで計数して決定します。ビーズの濃度が決定したら、18×10⁶個のビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。室温にて20,000×gで3分間遠心分離し、0.5〜1 mLのMESカップリングバッファーでビーズを2〜3回洗浄します。各洗浄ステップの遠心分離中に、ビーズの活性化に使用するため、新鮮なEDC/NHS MESバッファーを調製します。洗浄が完了したら、バッファーを室温または氷上に保持します。最終洗浄後、ビーズを50 µLのMESカップリングバッファーに再懸濁します。次に、ビーズ懸濁液に20 µLのEEC MESを加えます。ビーズ上のカルボキシ基を活性化させるため、室温で15分間、手動でピぺッティングを繰り返し、穏やかに混合してください。この工程は手間がかかりますが、この混合方法が混合後において最良の結果をもたらします。活性化させたビーズを、0.5～1 mLのPBSを用いて、室温で20,000 ×gにて3分間遠心分離し、2～3回洗浄します。各洗浄後、そして最終洗浄後、活性化ビーズを50 µLのPBSに再懸濁し、IP抗体をビーズに結合させます。0.2～1 mg/mLのストック濃度から、IPモノクローナル抗体を50 µL添加します。抗体以外の一次アミン含有分子が存在しないことを確認してください。Trisやウシ血清アルブミンなどのアミン含有分子は、ビーズへの結合において抗体と競合します。ビーズと抗体の懸濁液を、振動シェーカーを用いて室温で3〜4時間混合します。チューブの底にビーズが沈殿しないよう、十分に振盪してください。結合後、抗体コードビーズを0.5から1 mLのPBSで2〜3回洗浄し、20,000 ×gで遠心分離します。各洗浄後、室温で3分間、重力による沈殿を行います。最後に、ビーズを100 µLのQBSバッファーに再懸濁します。モノクローナル抗体のCMLビーズへの結合は、IgGに対する蛍光標識抗体でビーズを染色することで確認できます。FCM分析の後、モノクローナル抗体でコーティングしたビーズは、IP実験に使用するまで4 °Cで保存できます。まず、ビーズをPBSで1:200から1:10,000に十分に希釈して懸濁し、血球計数計でカウントします。IP実験ごとに使用するビーズの数を正確に制御するため、調製バッチごとに濃度を測定する必要があります。次に、水を用いて2% w/vの新鮮なdigin溶液を調製します。95 °Cで5分間加熱します。その後、氷上で冷却します。新鮮に調製した溶解バッファーを用いて1% w/vに希釈し、氷上に保持します。溶解させる細胞数は、ガイドラインとして提示されている表を用いて決定してください。ただし、必要となる細胞数は目的のタンパク質によって異なるため、経験的に決定する必要があります。ここでは、小リンパ球腫瘍細胞株から30 × 10⁶個の細胞を使用します。必要量の細胞懸濁液を1.5 mL遠心チューブに移します。20,000 ×gで細胞をペレット化します。4°Cで30秒間遠心分離し、培地を吸引除去します。適切量の調製直後のDig lysis bufferをペレットに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。その後、細胞を氷上で20分間静置し、溶解させます。細胞の種類や解析対象のタンパク質間相互作用によって細胞溶解条件は異なるため、溶解が完了したかは経験的に判断する必要があります。溶解液を20,000 ×gで遠心分離し、核および不溶性の細胞残渣を除去します。4°Cで10分間、重力による静置を行います。SNAを回収し、標的タンパク質を抗体コーティングビーズに結合させるため、ペレットを廃棄します。清澄化した溶解液に、50,000〜250,000個のモノクローナル抗体結合ビーズを、穏やかにピペッティングして加えます。1回のIPに使用するライセートの最小混合容量は5 µLです。清澄化したライセートとビーズの混合物を、ビーズが沈殿しない十分な速度に設定した冷室の回転式垂直ホイールに置き、4時間から一晩回転させます。回転中、液はチューブの底に留まっていても問題ありません。これにより、標的タンパク質がIP抗体に結合します。続いて、免疫複合体を蛍光標識します。IPビーズを1 mLの氷冷したFCMバッファーで2回洗浄し、4 °Cで3分間、20,000 ×gで遠心分離します。各洗浄後、ビーズを100 µLのFCMバッファーで再懸濁し、20 µLずつ5本以上のチューブに分注します。1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブまたはChimney Bottomプレートのウェルを使用します。どちらもここに示されています。サンプルに蛍光色素標識モノクローナル抗体を添加します。ベンダーの指示に従い、または経験的に決定した濃度を起点として、FCM染色を行います。チューブまたはウェルあたり、0.1 mg/mL以上のストック抗体溶液を0.2から1 µL加え、氷上で40分間インキュベートします。1.5 mLチューブ内のプローブ処理済みビーズを、氷冷した1 mLの洗浄液で2回洗浄します。FCMバッファーを用い、4°Cで3分間、20,000 ×gで遠心分離します。各洗浄後、ビーズを乱さないように注意しながら、上清を静かに除去します。あるいは、チムニー（column）の場合、4°Cで1000 ×gで5分間遠心分離し、0.2 µLの氷冷FCMバッファーで2回洗浄します。洗浄を繰り返してください。ビーズから上清を取り除くため、プレートを1回弾き、逆さまのままウェルの縁から滴り落ちる液を吸い取ります。ビーズを含む各ウェルの残量は約20 µLになります。サンプルあたり200 µLのFCMバッファーでビーズを懸濁し、ラベル付きのファルコンチューブに移します。これで、Becton Dickinson社のフローサイトメーターを用いたフローサイトメトリー（FCM）の準備が整いました。サンプル導入部または吸い込み口（sip）を囲んでいるドロップレット封じ込めスリーブを取り除きます。サンプル間のキャリーオーバーによるビーズの混入を防ぐため、サンプルの間に吸い込み口から液を滴下させてください。ここで使用するCMLビーズの直径は3～5 µmであり、これは静止期のマウスリンパ球の直径の約半分に相当します。したがって、ビーズのイベント集団をサイトメーターで検出させるために、前方散乱光（forward scatter）のアンプゲインと側方散乱光（side scatter）の電圧を手動で上げる必要がある場合があります。ここでは、ラベルなしのビーズまたはブランクビーズを用いてこれを行います。読み取り前に、ビーズ、ダブレット、およびデブリを除外するようにゲート設定を調整します。実験サンプルを用いることで、蛍光強度がスケール内に収まっていることを確認します。ラベルなしビーズを蛍光のネガティブコントロールとして使用し、レインボーキャリブレーション粒子（RCP）を蛍光のポジティブコントロールとして使用できます。RCPはCMLビーズよりも小さいため、そのサンプルの測定時には、前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のパラメータ、ならびにゲート位置を一時的に変更する必要がある場合があります。これらのキャリブレーション後、負および正の蛍光極値が対数軸上に表示されます。RCPによるキャリブレーションが完了したら、前方散乱光および側方散乱光の設定を未標識ビーズの設定に戻します。本実験のように、サンプルあたりに1種類の蛍光プローブのみを使用する場合は、蛍光補正は不要です。次に、蛍光データファイルを収集し、保存します。解析は、Cell QuestやFlowJoなどのフローサイトメトリーソフトウェアを用いて後ほど行います。ここでは、1% digit toinにおけるマウスT細胞LYのIP FCM解析の結果を示します。TCR CD3非タンパク質複合体は、抗CD3εビーズを用いてプルダウンされました。捕捉された複合体には、TCR βおよび共随伴するCD3 εが相当量含まれています。無関係な免疫グロブリンプローブ、またはTH 1.2、CD 45、H2-Kdに対する抗体を用いて測定したところ、他のタンパク質はバックグラウンドレベルに近い量しか検出されませんでした。免疫沈降後にウェスタンブロッティングを行うなどの他の手法に対する本手法の利点は、I-P-F-C-Mを用いることで、遺伝子工学的操作や大量のサンプルを必要とせずに、天然の状態でのタンパク質間相互作用を評価できる点にあります。I-P-F-C-Mは、少量の容量および低濃度の分析物で実施可能であるため、分析に利用可能な生体材料が極めて少ない場合でも高いS/N比を得ることができます。

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JoVE Journal

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フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

炎症は虚血性脳卒中の病因において中心的な役割を果たします。証拠の増加は、それが初期の脳損傷を悪化させるだけでなく、後の修復にも寄与する両刃の剣として機能することを示唆しています。このプロトコルは、虚血性脳からの免疫細胞の単離と、その後のフローサイトメトリー表現型について記述しています。...

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12)...

蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

この記事では、脂肪組織とフローサイトメトリーを使用して後続の解析から免疫細胞の分離による脂肪組織の免疫細胞の内容を分析する方法について説明します。...

フローサイトメトリーを用いたひと脂肪組織での免疫細胞のキャラクタリゼーション

フローサイトメトリーをイメージング細胞個々...

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。...

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

損傷した脊髄のミクログリア(MG)と末梢浸潤マクロファージ(Mø)の同定は困難です。このプロトコールでは、フローサイトメトリー(FCM)を使用して、それぞれM1様MG、M2様MG、M1様Mø、およびM2様Møを同定しました。この技術は、MGとMøの役割を理解するために、他の中枢神経系疾患にも適用できます。...

フローサイトメトリーを用いた損傷脊髄のミクログリアおよび末梢浸潤マクロファージの同定

学ぶIP-FCM法によるタンパク質複合体の検出。抗体結合ビーズで免疫沈降し、フローサイトメトリーで相互作用を解析。少量サンプルで高感度にタンパク質間相互作用を評価できる革新的な生化学的手法です。

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

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