IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

IP FCM実験では、相互作用するさまざまなタンパク質を同定および解析するために、ビーズを用いてタンパク質複合体を捕捉します。まず、目的のタンパク質に特異的な免疫沈降抗体をポリスチレンラテックスビーズに共有結合させます。次に、これらのビーズを細胞溶解液とともにインキュベートし、特定のタンパク質および相互作用するタンパク質をビーズに結合させます。

ビーズを捕捉したタンパク質と共に回収し、洗浄後、免疫共沈殿させたタンパク質に結合している可能性のある各種分子に特異的な蛍光標識抗体でプローブします。最後に、蛍光標識されたビーズをフローサイトメトリーで解析し、捕捉された複合体にどのタンパク質が存在し、あるいは欠損しているかを判定します。免疫共沈殿後のウェスタンブロッティングなどの他の手法に対する本手法（I-P-F-C-M）の利点は、遺伝子工学的な操作や大量のサンプルを必要とせずに、天然のタンパク質間相互作用を評価できる点にあります。

I-P-F-C-Mは、微量かつ低濃度の分析物で実施可能であるため、解析に利用できるバイオマテリアルが極めて少ない場合でも高いSN比を得ることができます。本手順を開始するために、以下の緩衝液を調製します：MESカップリング緩衝液、クエンチ・ブロッキング保存緩衝液（QBSと略称）、およびフローサイトメトリー（FCM）緩衝液。カルボキシ基修飾ポリスチレンラテックスビーズ（CMLビーズ）の濃度は、PBSで希釈し、血球計数器を用いて測定することで決定します。

ビーズの濃度が決定したら、1.8 × 10⁶個のビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。MESカップリングバッファー0.5〜1 mLを用いて、室温で20,000 ×gで3分間遠心分離し、ビーズを2〜3回洗浄します。各洗浄につき、ビーズの遠心分離を行っている間に。

ビーズの活性化に使用するための新鮮なEDC/NHS MESバッファーを調製します。洗浄が完了したら、バッファーを室温または氷上に保持してください。最終洗浄後、ビーズを50 µLのMESカップリングバッファーに再懸濁します。

次に、ビーズ懸濁液に20 µLのEEC MESを加えます。ビーズ上のカルボキシル基を活性化させるため、室温でピペッティングを15分間継続的に繰り返し、緩やかに混合します。この工程は手間がかかりますが、この混合方法により、混合後の最良の結果が得られます。

活性化ビーズを、0.5～1 mLのPBSで、室温にて20,000 ×gで3分間遠心分離し、2～3回洗浄します。最終洗浄後、活性化ビーズを50 µLのPBSに再懸濁させ、IP抗体をビーズに結合させます。ここに、0.2～1 mg/mLのストック濃度で調製したIPモノクローナル抗体を50 µL添加します。

抗体以外の一次アミン含有分子が存在しないことを確認してください。Trisやウシ血清アルブミンなどのアミン含有分子は、ビーズへの結合において抗体と競合します。ビーズと抗体の懸濁液を、室温の振動シェーカーで3〜4時間混合します。

ビーズがチューブの底に沈殿するのを防ぐため、十分に振とうしてください。結合後、抗体コーティングビーズを0.5〜1 mLのPBSで2〜3回洗浄し、20,000 ×gで遠心分離します。

各洗浄後、室温で3分間静置して沈殿させます。最後に、ビーズを100 µLのQBSバッファーに再懸濁します。モノクローナル抗体のCMLビーズへの結合は、IgGに対する蛍光標識抗体でビーズを染色することで確認できます。

FCM分析の後、モノクローナル抗体でコートしたビーズは、IP実験で使用するまで4°Cで保存できます。まず、ビーズをPBSで1/200から1/10,000に十分に希釈して懸濁させ、ヘモサイトメーターでカウントします。各IP実験で使用するビーズの数を正確に制御するため、調製バッチごとに濃度を測定する必要があります。

次に、2%（w/v）の新鮮なdig溶液を水で調製します。95 °Cで5分間加熱した後、氷上で冷却してください。

新鮮に調製した溶解バッファーで1% w/vに希釈し、氷上で保持します。溶解させる細胞数は、ガイドラインとして示されている表を用いて決定してください。ただし、必要とされる細胞数は目的タンパク質によって異なるため、実証的に決定する必要があります。

ここでは、小リンパ球腫瘍細胞株から 30 × 10⁶ 個の細胞を使用します。必要な容量の細胞懸濁液を 1.5 mL セントリフュージチューブに移します。20,000 ×g で遠心分離し、細胞をペレット化します。

4 °Cで30秒間遠心分離し、培地を吸引除去します。適切量の調製直後のDigitonin溶解バッファーをペレットに加え、ピペッティングにより穏やかに混合します。

その後、細胞を氷上で20分間放置して溶解させます。細胞の種類や解析対象のタンパク質間相互作用によって、細胞溶解条件は異なる場合があり、溶解が完了したかどうかは経験的に決定する必要があることに注意してください。溶解物を20,000 ×gで遠心分離し、核および不溶性の細胞残渣を除去します。

4 °Cで10分間、重力による遠心分離を行います。SNAを回収し、ペレットを廃棄して、標的タンパク質を抗体コートビーズに結合させます。澄明化したライセートに、50,000から250,000個のモノクローナル抗体結合ビーズを、穏やかにピペッティングして加えます。

単一のIPに使用するライセートの最小混合量は5 µLです。清澄化したライセートとビーズの混合物を、ビーズが沈殿しない十分な速度に設定したコールドルーム内の回転垂直ホイールに、4時間から一晩置いておきます。回転中、チューブの底部に液体が残る場合があります。これにより、標的タンパク質がIP抗体に結合します。

免疫複合体の蛍光標識を行います。IPビーズを1 mLの氷冷したFCMバッファーで2回洗浄し、4°Cで20,000 ×gにて3分間遠心分離します。各洗浄後、ビーズを100 µLのFCMバッファーに再懸濁し、20 µLずつ5つ以上のチューブに分注します。

1.5 mLのマイクロ centrifugeチューブ、またはchimney bottomプレートのウェルを使用します。ここでは両方を示しています。サンプルに蛍光色素標識モノクローナル抗体を添加します。

ベンダーの指示に従うか、または経験的に決定した濃度を起点としてFCM染色の操作を行います。1本または1ウェルあたり、0.1 mg/mL以上のストック抗体溶液を0.2〜1 µL添加し、氷上で40分間インキュベートします。1.5 mLチューブ内のプローブ処理済みビーズを、氷冷した1 mLの洗浄液で2回洗浄します。

FCMバッファーを用い、4°Cで3分間、20,000 ×gで遠心分離します。各洗浄後、ビーズを乱さないように注意しながら、上清を静かに除去します。

あるいは、チムニー（集積部）および底板を、0.2 mLの氷冷FCMバッファーで2回洗浄し、4°Cで5分間、1000 ×gで遠心分離します。洗浄は毎回繰り返します。ビーズから上清を除去するため、プレートを1回軽く叩いた後、逆さまのままウェルの縁から滴り落ちる液を吸い取ります。

ビーズを含む各ウェルの残液量は約20 µLになります。サンプルごとに200 µLのFCMバッファーでビーズを懸濁し、ラベル付きのファルコンチューブに移します。これで、Becton Dickinson社製のフローサイトメーターによるフローサイトメトリー（FCM）解析が可能な状態になります。

サンプル導入部またはサップ（sip）を囲んでいるドロップレット封じ込めスリーブを取り外します。サンプル間にサップから液を滴下させてください。これにより、あるサンプルから別のサンプルへビーズがキャリーオーバーすることを防げます。ここで使用するCMLビーズの直径は3〜5 µmであり、これは静止期のマウスリンパ球の直径の約半分に相当します。

したがって、ビーズイベントの集団をサイトメーターで検出させるために、前方散乱光（forward scatter）のアンプゲインおよび側方散乱光（side scatter）の電圧を手動で上げる必要がある場合があります。ここでは、ラベルなしまたはブランクのビーズを用いてこれを行います。読取前に、ビーズ、ダブレット、およびデブリを除外するようにゲートの設定を調整します。

実験試料を用いることで、蛍光強度がスケール内に収まっていることを確認します。未標識ビーズを蛍光の陰性コントロールとして使用し、レインボーキャリブレーション粒子（RCP）を蛍光の陽性コントロールとして使用できます。RCPはCMLビーズよりも小さいため、その試料については前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）のパラメータ、ならびにゲート位置を一時的に変更する必要がある場合があります。

これらのキャリブレーション後、陰性と陽性の蛍光極値が対数軸上に表示されます。RCPによるキャリブレーションが完了したら、前方散乱光および側方散乱光の設定を非標識ビーズの設定に戻してください。本実験のように、1サンプルあたり1種類の蛍光プローブのみを使用する場合は、蛍光補正を行う必要はありません。

次に、蛍光データファイルを取得し保存します。解析はその後、CellQuestやFlowJoなどのフローサイトメトリー用ソフトウェアを用いて行います。ここでは、1% digitoninを用いたマウスT細胞溶解液のIP FCM解析の結果を示します。TCR CD3非タンパク質複合体は、anti-CD3εビーズを用いてプルダウンされました。

捕捉された複合体には、かなりの量のTCR βおよび共随伴するCD3 εが含まれています。無関係な免疫グロブリンプローブ、またはTH 1.2、CD 45、H2-Kdに対する抗体を用いて測定したところ、他のタンパク質はバックグラウンドレベルに近い量しか検出されませんでした。免疫沈降後にウェスタンブロッティングを行うなどの他の手法と比較した本手法の利点は、I-P-F-C-Mを用いることで、遺伝子工学的な操作や大量のサンプルを必要とせずに、天然のタンパク質間相互作用を評価できる点にあります。I-P-F-C-Mは、少量の容量および低濃度の分析物で実施可能であるため、分析に利用可能なバイオマテリアルが極めて少ない場合でも、高いS/N比を得ることができます。