Name: カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶカポジ肉腫組織の二重免疫組織化学ラベリング法。KSHVと宿主細胞タンパク質を同時可視化し、腫瘍生物学の理解と新規治療標的の同定に貢献する技術を習得する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は彼のアドバイスとこの原稿の見直しのためにジェームズEKヒルドレス、メハリー医科大学を、感謝。我々はまた、原稿の編集にダイアナマーバーに感謝。エイズの健康格差研究センター、NIHの助成金5U54 RR019192 - 05;臨床研究のためのメハリーセンター、NIHグラントP20RR011792、この作品は、エイズ研究のためのメハリーヴァンダービルトセンター（NIHの助成金P30 AI054999 - 05）によってサポートされ、NIHで助成金P01 CA113239。 DJAは部分的にエイズ研究のためのヴァンダービルト - メハリーセンター（CFAR）と臨床研究​​のためのメハリーセンター（CRC）からのパイロットの補助金によって賄われていた。

<ol><li>Sitas, F., Newton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma in South Africa.</a> J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).</li>
<li>Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+PS+%22Field%27s+Virology%22">Field's Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).</li>
<li>Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles, D. M., Moore, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P., Said, J. W., Knowles, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N Engl J Med. 18, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Cesarman, E., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+a+lymphotropic+human+herpesvirus+associated+with+Kaposi%27s+sarcoma%2C+primary+effusion+lymphoma%2C+and+multicentric+Castleman%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a lymphotropic human herpesvirus associated with Kaposi's sarcoma, primary effusion lymphoma, and multicentric Castleman's disease.</a> Semin Diagn Pathol. 14, 54-66 (1997).</li>
<li>Chiou, C. J., Poole, L. J., Kim, P. S., Ciufo, D. M., Cannon, J. S., ap Rhys, C. M., Alcendor, D. J., Zong, J. C., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+and+a+transactivation+function+exhibited+by+the+vGCR+%28ORF74%29+chemokine+receptor+protein+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus.</a> J Virol. 76, 3421-3439 (2002).</li>
<li>Staskus, K. A., Zhong, W., Gebhard, K., Herndier, B., Wang, H., Renne, R., Beneke, J., Pudney, J., Anderson, D. J., Ganem, D., Haase, A. T., T, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+gene+expression+in+endothelial+%28spindle%29+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus gene expression in endothelial (spindle) tumor cells.</a> J Virol. 71, 715-719 (1997).</li>
<li>Alcendor, D. J., Zhu, W. Q., Desai, P., Vigil, H. E., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSHV+downregulation+of+galectin-3+in+kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">KSHV downregulation of galectin-3 in kaposi's sarcoma.</a> Glycobiology. , (2009).</li>
<li>Ciufo, D. M., Cannon, J. S., Poole, L. J., Wu, F. Y., Murray, P., Ambinder, R. F., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+cell+conversion+by+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus%3A+formation+of+colonies+and+plaques+with+mixed+lytic+and+latent+gene+expression+in+infected+primary+dermal+microvascular+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Spindle cell conversion by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: formation of colonies and plaques with mixed lytic and latent gene expression in infected primary dermal microvascular endothelial cell cultures.</a> J Virol. 75, 5614-5626 (2001).</li>
<li>Long, E., Ilie, M., Hofman, V., Havet, K., Selva, E., Butori, C., Lacour, J. P., Nelson, A. M., Cathomas, G., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LANA-1%2C+Bcl-2%2C+Mcl-1+and+HIF-1alpha+protein+expression+in+HIV-associated+Kaposi+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">LANA-1, Bcl-2, Mcl-1 and HIF-1alpha protein expression in HIV-associated Kaposi sarcoma.</a> Virchows Arch. 2, 159-170 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレポートで使用されている手法は、実験室のさまざまな設定で行うことができます。彼らはいくつかの特別な機器やコア施設へのアクセスが必要です。 biosafteyレベル3（BSL - 3）施設の使用が必要な場合がありますKSHVのような感染性ウイルス性病原体が関与する実験を行うときに適切な予防措置が取られている必要があります。組織の買収は、適切な制度審査委員会（IRBの）によって承認されなければならない。 これらの方法論は、一緒にin vitroでの発現に調節不全および in vivoならびに遺伝子発現プロファイルの検証内皮細胞での遺伝子送達のための戦略のために定義されたメソッドを提供している遺伝子を同定するための基礎を提供することができます。一緒にこれらの知見は、特定のウイルス遺伝子が続いてKSHV感染により影響を受けるとされている生化学的経路の解明に役立つことがあります。 KSHVのような発癌性ウイルスは特定の分子経路を中断する方法についての理解は、新規治療薬の開発に洞察を提供することができます。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2培地</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ bullet kits サプリメント</td></tr><tr><td>DMVEC細胞 (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>KSHV LANA Mab</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50希釈/IFA</td></tr><tr><td>Galectin-3 goat pAb</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー抗ヤギ FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー抗ヤギ Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100希釈/IFA</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>DAPI含有Vectashield</td></tr><tr><td>BCAタンパク質定量アッセイキット</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー抗ヤギ複合体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタン基質</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギ抗ヤギ</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-ストレプトアビジン複合体</td><td>Dako</td><td>K 0492 (キット)</td><td></td></tr><tr><td>RNase DNase Free Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>バイオフォトメーター</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>RC 6 Plus 遠心機</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Optima L-90K 超遠心機</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>MYiQ iCycler リアルタイムPCR検出システム</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>TE 2000S 蛍光顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 遠心機</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（kshv）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

現在、KSは、南部アフリカで最も優勢なHIV / AIDS関連悪性腫瘍であり、それゆえ世界。1,2は、それが血管内皮細胞のangioproliferative腫瘍として特徴付けられると胸水のリンパ腫の形態では珍しいB細胞リンパ増殖性疾患（PEL）を生成と多中心性キャッスルマン病のいくつかの形態が。KSの細胞の 3〜5 1〜5％が積極的にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、KSに関連付けられている病原体の溶菌複製をサポートしている病変、それは細胞因子が必要があることは明らかです。発癌と腫瘍の進行の過程におけるウイルス因子と相互作用。KS病理学に寄与する6,7の識別小説ホスト因子の決定要因は、KSの治療のための新たな治療薬を開発するなど、同様に腫瘍の進行や転移の予後マーカーを開発するために不可欠です。 dysregulated遺伝子をマイクロアレイ解析により識別されれば8付属のビデオの詳細我々はKSHV感染後、KS腫瘍組織における皮膚微小血管内皮細胞（DMVEC）に変更された宿主細胞の遺伝子発現プログラムを識別するために使用するメソッドは9、タンパク質発現の変化はイムノブロットおよびデュアルラベル付け免疫蛍光法によって確認した。調節不全の遺伝子の転写発現の変化を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量RT - PCR） により in vitro で確認されています。アーカイブKS腫瘍組織を用いた in vitroの結果での検証は、デュアル標識した免疫化学と組織マイクロアレイによって実行されます。8,10我々のアプローチは、in vitroで 、その後、in vivoモデル系での開発ができるようになりますKS腫瘍組織の微小環境での調節不全遺伝子を特定するKSの治療のための潜在的な新規治療薬の発見と評価。

宿主細胞因子がカポジ肉腫（KS）の確立と維持において重要な役割を果たす。我々は、KSHV感染DMVEC細胞に、とKS腫瘍組織に改変宿主細胞因子を特定する方法の概要を示します。ウイルスによって変更さ細胞の遺伝子は、新規な治療のための潜在的なターゲット（複数可）として機能します。

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

現在、カポジ肉腫（KS）は南部アフリカ、ひいては世界において、HIV/AIDSに関連する最も主要な悪性腫瘍である1,2。本疾患は、血管増殖性の...

この手順の全体的な目的は、免疫組織化学を用いて、カポジ肉腫の腫瘍組織におけるウイルスおよび宿主細胞タンパク質の二重染色を実証することである。これは、まず熱を用いて抗原を露出させることで達成される。手順の第2ステップは、ビオチン標識一次抗体を適用することである。手順の第3ステップは、strep din酵素複合体の添加です。手順の最終ステップは、発色させるために組織に酵素基質を添加することです。最終的に、免疫組織化学染色を通じて、腫瘍組織におけるウイルスおよび宿主細胞タンパク質の両方の局在を示す結果を得ることができます。本手法は、同一の検体から感染剤および発現異常のある細胞遺伝子を同定するなど、病理学分野における重要な疑問を解決することができます。ドラフトチャンバー内で、固定パラフィン包埋組織の 5 µm 切片を貼付したスライドガラスを最大8枚、キシレンを満たしたコプランジャーに入れます。10分間インキュベートして脱パラフィンを行い、二重標識免疫組織化学染色のためのスライド準備を完了させます。組織を100%、95%、70%のエタノール溶液の段階的なシリーズで、それぞれ5分間再水和させます。抗原賦活化（抗原リカバリーとも呼ばれる）を行う前に、スライドを水に少なくとも10分間浸します。抗原賦活化のため、スライドを新しく調製した95 °Cの溶液が入ったプラスチック容器に浸します。50 millimolar クエン酸緩衝液を電子レンジで加熱し、95 °Cで15分間沸騰状態を維持します。直ちにスライドを室温の蒸留水が入ったコプラン容器に移します。その後、スライドを調製したばかりのクエンチ液で満たした清潔なコプラン容器に移します。内因性ペルオキシダーゼをクエンチするため、室温で30分間インキュベートします。室温の1xPBSで、1回5分間、計3回洗浄します。スライドをPBS洗浄液から取り出して余分な液を振り落とし、200 µLの氷冷ブロッキング溶液を組織に滴下して、乾燥を防ぐためにパラフィンストリップで覆います。スライドを加湿チャンバーに入れ、室温で1時間インキュベートします。パラフィンストリップを取り除き、スライド上の過剰なブロッキング溶液を振り落とします。組織を覆うように、ブロッキングバッファーで希釈した氷冷KSHV Lana一次抗体を50～100 µL滴下します。新しいパラフィンストリップで組織を覆い、加湿チャンバー内で1～2時間インキュベートします。スライドを1 XPBSで5分間、3回洗浄します。各洗浄後、1 XPBSで希釈したビオチン化二次抗体を50〜100 µL添加し、加湿チャンバー内で室温にて30〜45分間インキュベートします。スライドのインキュベーション中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを調製します。daco animation duet kitを使

identifying-dysregulated-genes-induced-kaposi-s-sarcoma-associated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス -...

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。...

蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。...

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

我々は、ヒトのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）、およびエプスタイン-バーウイルス（EBV）に密接に関連しているモデルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス68（γHV68）に感染したマウスにおける抗ウイルスサイトカイン産生を測定するためのプロトコルを記載している。遺伝的に改変されたマウス系統およびマウス胚線維芽細胞（MEF）を利用して、我々は、in vivoおよびex vivoの両方の抗ウイルス性サイトカイン産生を評価した。レンチウイルス形質導入によるノックアウト胚性線維芽細胞における自然免疫成分の発現を「再構成」、我々はさらに、特定の自然免疫の分子を特定し、差別的な抗ウイルスサイトカイン産生を調節する重要なシグナル伝達事象を分析。...

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV...

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。...

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

このプロトコルは、BAC16由来のビリオンを使用して、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのde novo溶解感染をモデル化するin...

無細胞カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる De Novo 溶解性感染の確立と定量化

学ぶカポジ肉腫組織の二重免疫組織化学ラベリング法。KSHVと宿主細胞タンパク質を同時可視化し、腫瘍生物学の理解と新規治療標的の同定に貢献する技術を習得する。

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

さらに動画を探す