Name: リボプローブを用いたバタフライ蛹ウィングスのためのその場プロトコルで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学ぶリボプローブを用いたその場ハイブリダイゼーション法で、Bicyclus anynanaの蛹期翅における遺伝子発現を解析する最適化プロトコルです。他の鱗翅目種への応用指針も提供し、発生生物学研究に貢献します。

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私たちは、ジェーンSelegue、マーガレットホリングスワース、ジンベリー、亮Futahashi、NajmusサハルMahfooz、アレクサンダルPopadic、ボブリード、このプロトコルのトラブルシューティングに役立つためにロシュテクニカルサポートに感謝。我々はまた、ムービーの編集上のアドバイスをウィリアムピールに感謝。

1日目<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ul><li> 10倍PBS </li><li> 1X PBS </li><li> 1X PBT </li><li>のddH 2 O <ul><li> 0.1パーセント合計ボリュームに対して、DEPCを追加し、積極的にソリューションを振る。 </li><li>オートクレーブ。 </li></ul></li><li> 4％パラホルムアルデヒド修正 - PBS - DEPCを使用して</li><li>プロテイナーゼK溶液 - アリコートを取り外す前に、精力的に沈殿物が存在する場合には、渦</li><li>消化ストップバッファー</li><li>プレハイブリダイゼーションバッファー</li><li> 50:50 PBT：プレハイブリダイゼーションバッファー</li><li>ハイブリダイゼーションバッファー<ul><li>ソリューションは、RNaseフリーに保つ必要があります。どちら焼きされたガラスウエア（250で4時間° C）または使い捨てのプラスチックを使用してください。血清学的ピペットは、ソリューションを構成するために非常に便利です</li></ul></li></ul></li><li> PBS中で蛹を上演時から翼を解剖する</li><li>室温で24穴培養プレートのウェルにバッファを修正するために直接翼を移動する</li><li> 2時間のディスクを修正</li><li> PBTで5 × ​​5分間洗浄</li><li>プロティナーゼK溶液で3分間の翼をインキュベート</li><li>消化ストップバッファーで2 ×をすすぐ</li><li> PBTで5 × ​​5分間洗浄</li><li> PHB：50:50 PBTの2 × 5分間洗浄</li><li> PHBの1 × 10分間洗浄</li><li> 55 PHB少なくとも1時間のインキュベート℃の</li><li>熱変性RNAプローブ（20 - 50ngよくごとに必要な）（80℃で5分間）とハイブリダイゼーション緩衝液（100μlのウェル毎に必要）に追加</li><li>ウェルにプローブを追加し、55℃で48時間インキュベート° C </li></ol> 3日目<ol><li> 55で4 × 5分間洗浄° C PHB </li><li> 55 PHBで一晩インキュベート° C </li></ol> 4日目<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ul><li>抗体のブロックバッファ</li></ul></li><li> PHB：50:50 PBTで1 × 5分間洗浄</li><li> PBTで4 × 5分間洗浄</li><li> 4のブロックバッファ内で1時間インキュベート翼は° C </li><li>一晩4抗DIG抗体の1:2000希釈で翼をインキュベート° C </li></ol> 5日目<ol><li>以下のソリューションを準備します。 <ul><li>検出バッファー</li></ul><ul><li>現像液 - 敏感な光（ホイルでラップ） </li></ul></li><li>室温でPBTの3 × 5分間洗浄</li><li> PBTで洗浄7 × 5分</li><li>検出用バッファー中で翼を2回リンス</li><li>ソリューションの開発の1 mlの翼を開発 - 開発の時間は、それぞれの時間を監視する必要がある - 時間を開発する同じプローブを使用してソリューションを開発する際にも変更できる - 一般的には一晩に間隔を増やしてから5-10分後にチェックして。プレートは、サンプルをチェックしない場合は光の暴露を防止するためにホイルで包まれるべきである。 </li><li>開発停止バッファーで5回リンス</li><li>翼をマウントします。 </li></ol>

<ol><li>Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+eyespot+determination+in+butterfly+wings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings.</a> Science. 265, 109-114 (1994).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+in+formamide+protects+RNA+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Solubilization in formamide protects RNA from degradation.</a> Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).</li>
<li>Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+hedgehog+regulatory+circuit+in+butterfly+eyespot+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution.</a> Science. 283, 532-534 (1999).</li>
<li>Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+transformation+of+the+butterfly+Bicyclus+anynana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+%28Suppl%29%22%5BJournal%5D)">Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana.</a> Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).</li>
<li>Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+insights+into+questions+of+lepidopteran+wing+pattern+homology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology.</a> BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).</li>
<li>Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+control+of+transgene+expresson+using+laser+induction+of+the+hsp70+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter.</a> BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).</li>
<li>Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+function+in+butterfly+wings+and+the+evolution+of+insect+wing+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns.</a> 9, 109-115 (1999).</li>
</ol>

既存のプロトコルの最適化 （。。らキーズ1999;。ウェザーら1999。キャロルら1994）幼虫の翼ディスクが正常にPRECIS coeniaの蝶からディスクを使用して実行されているのin situハイブリダイゼーション。現在のプロトコルは、幼虫の翼stainingsのためのキャロルの研究室からのリクエストも承ります詳細な書面によるプロトコルから適応されています。我々が行った変更は、幼虫と蛹の翅の組織の違いに対応するために役立つ。蛹hindwing解剖時には、peripodial膜を除去する必要がありますし、井戸に含まれていません。最初の修正の時間は、我々のプロトコルではるかに長いですが、事後修正のステップは削除されました。我々はまだ成功したプローブの浸透を可能にしながらプロティナーゼK溶液の10倍希釈が壊れやすい蛹の翼の組織のために必要であることがわかった。私たちは、一晩4℃で増加信号強度に抗体のインキュベーションを増加させるのに対し、抗体染色の前に翼をブロックして大幅にバックグラウンドを減少させることをもを発見した。 アプリケーションこのプロトコルのアプリケーションは多様です。開発蛹の翼上に候補遺伝子の発現をローカライズするためにで...

<table><tbody><tr><td>固定バッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS含有4% パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td></td><td>PBS含有0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Proteinase K溶液</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT含有2.5&amp;#109;g/ml Proteinase K</td></tr><tr><td>消化停止バッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>PBT含有2 mg/ml グリシン</td></tr><tr><td>前ハイブリダイゼーションバッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>PHB 50 mlあたり：DEPC処理水 12 ml + ホルムアミド 25 ml + 20 x SSC 12.5 ml + Tween 20 50 ul + 10 mg/ml 鮭精子DNA 500 ul（RNaseフリー、溶液への添加前に熱変性させる）。</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>前ハイブリダイゼーションバッファーに1 mg/ml グリコーゲンを添加</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td></td><td></td><td></td><td>50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA</td></tr><tr><td>Anti-DIG</td><td>抗体</td><td>Roche Group</td><td>11 093 274 910</td><td>アルカリフォスファターゼ標識</td></tr><tr><td>DIG洗浄およびブロッキングバッファーセット</td><td></td><td>Roche Group</td><td>11 585 762 001</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Mount Aqueous Mounting Medium</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0612</td><td>封入剤</td></tr></tbody></table>

リボプローブを用いたバタフライ蛹ウィングスのためのその場プロトコルで

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

ここでは、ビデオフォーマットで、リボプローブを使用して蝶Bicyclus anynanaの蛹の翼のサイチュハイブリダイゼーションのためのプロトコルを提示する。サイチュハイブリダイゼーションでは、発生生物学の主流は、転写レベルでの組織を開発する際に遺伝子発現の空間的および時間的パターンを研究するのに便利です。遺伝子の転写のタンパク質産物はまだ開発、および/または内臓で、入手可能な抗体を用いて区別することができないゲノムの特定のタンパク質の複数の遺伝子のコピーが存在していないターゲット抗体が代わりに使用することができる場合。幼虫の翼のディスクの現場テクニックで数年間、蝶のコミュニティに利用されていますが、現在のプロトコルは、より大規模で脆弱な蛹の翼のために最適化されています。

Bicyclus anynanaの蛹の翼の組織における遺伝子発現を調べるために、我々はリボプローブを用いてサイチュハイブリダイゼーションのために最適化されたプロトコルを提示する。我々はまた、他のチョウ目の種の蛹の翼で使用するためにこのプロトコルのさらなる最適化のためのガイドラインを提供しています。

ここでは、リボプローブを用いたチョウの一種 *Bicyclus anynana* の蛹の翅におけるin situハイブリダイゼーションのプロトコルをビデオ形式で提示します。in situ...

これは、蛹化段階のチョウの翅におけるcetoプロトコルです。まず、ケージから前蛹を回収してトレイに置き、タイムラプス撮影を用いて正確な蛹化時間を撮影します。これにより、蛹化後の正確なタイミングで染色を行うことが可能になります。異なるタンパク質をコードする異なるmRNAは、パピレーション後の異なるタイミングで発現するため、この操作は重要です。ここでは、シリコンベースのペトリ皿を用いて蛹の翅を解剖しています。重要な点は、翅を取り除いて固定液に入れる際、完全に平らにすることです。この段階で平らにしておかないと、後で平らにすることは不可能です。適切な固定時間の後、固定バッファーを除去し、5回洗浄します。PBTにおいてプロテイナーゼK処理の工程は非常に重要であり、プローブが浸透できるように組織を透過処理するために行われます。そのため、これらのリンスおよび洗浄によって、適切なタイミングで処理を停止させる必要があります。サケ精子は、プローブが非特異的に結合するのを防ぐための安価なDNA源として機能します。精子はプレハイブリダイゼーションバッファーの成分の一つです。ここでは、プレハイブリダイゼーションバッファーに精子を添加し、PBTとプレハイブリダイゼーションバッファーを半分ずつ混合した 1 50 50 P-B-T-P-H-B 溶液を作成します。この溶液は、翅をPBT溶液（浸漬用）からプレハイブリダイゼーション溶液へと緩やかに移行させるための中間溶液として使用されます。そこで、翼を最初にこの50:50溶液に浸しておくという中間ステップを設けます。ここでは、翼をPHPで10分間インキュベートし、その後再びPHPで55 °Cで1時間インキュベートします。その間に、プレハイブリダイゼーションバッファーにグリコーゲンを混ぜ合わせたハイブリダイゼーションバッファーを調製します。ここで、少量のハイブリダイゼーションバッファーを作成するために、PHVにグリコーゲンを添加しています。このバッファーに、変性させたプローブを添加します。ヒートブロックを予熱し、-20℃で保存されていたプローブをスピンダウンさせ、変性させるために必要な量のプローブのみをチューブに移し、80℃で約5分間加熱します。ここでは2つのプローブを同時に変性させているため、プローブにハイブリダイゼーションバッファーを加え、その後、各ウェルにプローブミックスを100 µLずつ添加します。このステップを完了させるために、すべてのウェルをパラフィルムで覆います。翅はその後2日間 55 °C でインキュベートされるため、パラフィルムで蒸発を防ぎます。2日間のインキュベーション後、PBSで翅を洗浄することでプローブを除去し、最後の洗浄液をさらに12〜24時間翅に保持させます。最後に、一連の洗浄ステップを経て、翅を再びPBT溶液に戻します。ここでも、途中で50:50の混合溶液を使用します。この段階で、抗体ブロッキング溶液を翅に添加し、アルカリフォスファターゼ結合抗dig抗体をPBTに加え、濃度を約1:2000に調製します。この抗体溶液を各ウェルに約300 µLずつ添加し、翅を冷蔵庫に入れて一晩抗体でインキュベートします。翌日、PBTで数回洗浄して抗体を除去し、その後、室温で検出バッファーを用いて翅を2回すすぎます。最後に、各ウェルに1 mLの現像液を加え、アルミホイルで速やかに翅を覆います。約10分後、状態を確認すると、翅が紫色に色づき始めていますが、まだ少し色が薄い状態です。そのため、再び覆い、数分後に再度確認すると、色が少し濃くなっています。異なるプローブでインキュベートした翅は、わずかに異なる速度で暗色化したように見えました。そのため、再度翅を覆うことにし、最終的に20分後に発色停止バッファーで反応を停止させます。これで翅をスライドガラスに封入する準備が整いました。ラベルを貼ったスライドガラスに封入剤を少量滴下し、ピンセットで翅を拾い上げて滴上の上に置きます。気泡を取り除き、翅をゆっくりと伸ばしてからカバーガラスで覆います。本実験では、grail遺伝子の転写物を標的とするプローブを用い、蝶のCyclist ananaにおける翅の脈形成の初期段階において、将来のIPOパターンの中心にこれらが局在していることを確認します。

in-situ-protocol-for-butterfly-pupal-wings-using-riboprobes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

全マウントを使用するその場で</em分子とOrganismal生物学をリンクする>ハイブリダイゼーション

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

ここで、我々は、効率的な高スループットを記述...

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、...

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Xenopus laevisの胚は、その大きなサイズと操作の容易さから、初期発生の研究において非常に有用であり続けています。  このモデルシステムにおける特定の臓器の同定に使用できる、全マウントin...

簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。...

の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。...

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

正確にショウジョウバエのティッシュの成績証明書または蛋白質を検出する能力は、その豊かさとローカライズ開発プロセスに関連の勉強にとって重要です。ここ蛹翼を分析する簡単な手順の説明です。これらの翼は、いくつかのテクニック(免疫組織化学、PCR...

Immunodetections または PCR の試金に適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖する迅速かつ効率的な方法

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

このプロトコルは、シプンキュラス・ヌダス・コエロミック流体中の標的遺伝子のmRNA発現レベルおよび空間パターンを検出するための、その場合のハイブリダイゼーションアプローチに有効であることを説明する。...

シチュヌチュ・ニュードゥス・コロミック流体のハイブリダイゼーションで

学ぶリボプローブを用いたその場ハイブリダイゼーション法で、Bicyclus anynanaの蛹期翅における遺伝子発現を解析する最適化プロトコルです。他の鱗翅目種への応用指針も提供し、発生生物学研究に貢献します。

リボプローブを用いたバタフライ蛹ウィングスのためのその場プロトコルで

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