二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）と生物学的構造の差イメージング

このビデオでは、コヒーレント・ラマン散乱信号を持つ生物学的構造に関連する2つのラマン共鳴の差分イメージングを行う手順を実演します。まず、同期させた3本の短パルスレーザーを時間的および空間的に重ね合わせます。次に、重ね合わせたパルスを標準的な倒立顕微鏡に導入することで、微小物体からコヒーレント・ラマン信号を生成させます。

得られた異なるラマン信号を比較するため、市販のソフトウェアを用いて信号を画像に変換します。その結果、二重共鳴ラマン信号と単一共鳴ラマン信号から得られた画像の差分をとることで、弱いラマン信号に対する感度が向上することが示されました。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校バイオフォトニクスセンターのTyler Weeksです。

カリフォルニア大学デービス校のバイオフォトニクスセンターおよび内科学教室のThomas ERです。本日は、化学的に特異的な細胞画像を作成するための、二重共鳴コヒーレント反ストークス・ラマン散乱を用いる手法をご紹介します。この手法を用いることで、コヒーレント反ストークス・ラマン分光法のみでは直接検出することができない、信号強度の弱い分子の検出が可能になります。

それでは始めていきましょう。CARSおよびdrCARS信号を同時に発生させるには、同調および同期させた3つの短パルスレーザー光源が必要となります。これらの同期パルスを得るために、まずは出力10 W、波長1064 nm、パルス幅7 ps、繰り返し周波数76 MHzの固定仕様である単一の短パルスレーザーから開始します。

一連の半波長プレートと偏光ビームスプリッターキューブを用いて、ビームを3つの部分に分割します。半波長プレートと偏光ビームスプリッターキューブを組み合わせることで、ビームの方向を変えずに各成分の出力を調整することが可能です。通常、2つのビームをそれぞれ約4.5 Wに調整し、3つ目のビームに残り1 Wを割り当てます。

次に、2本の高出力ビームを2つの独立した光パラメトリック発振器（OPO）に導入します。OPOは異なる周波数生成を利用して、高エネルギー光子を異なる波長を持つ2つの低エネルギー光子に変換します。この効果を得るために使用される結晶の温度を制御することで、得られる光子の波長を0.1 nanometers以内の精度で制御することが可能です。

これらの信号を周波数倍増させることで、波長1064 nanometersの固定波長レーザーを、同一の1064 nanometer光源で2つの独立したOPOを励起し、780 nanometersから910 nanometersの間で任意に波長可変なレーザービームに変換することが可能になります。これにより、元のポンプレーザーに自動的に同期した、独立して波長可変な2つのレーザー光源が得られます。1064 nanometerポンプレーザーからの3番目のビームは、誘電体ミラーの組み合わせによってOPOの周囲に導かれ、後に3本のビームすべてを再結合できるようにします。

コヒーレントなラマン信号光子を効率的に生成するためには、再結合させるパルスを時間的および空間的に重ね合わせる必要があります。OPOはリング共振器を含んでおり、各レーザーパルスが結晶を複数回通過するため、OPOを通過したビームは追加の距離を移動することになり、元のポンプビームに対して大幅な遅延が生じます。この距離は、ダイクロイックミラーを用いて再結合させる前に、他の2本のビームと同じ距離を移動させるようにミラーを追加した3本目のビームによって補正し、光路長の微調整を行います。各ビームは調整可能なディレイステージを通過し、これにより異なるレーザーパルスの時間的な重なりを調整することができます。

各ビームに別のハーフウェーブプレートと偏光ビームスプリッターキューブを追加し、各ビームのレーザー出力を独立して調整できるようにします。ダイクロイックミラーを使用して、まず2つのOPOからのビームを結合させ、次に1064 nanometerのビームを結合させます。この際、ビームが空間的に正確に重なるように注意する必要があります。これは、ダイクロイックミラーから数センチメートルの位置でのビームの重なりと、ダイクロイックミラーから約1メートルの位置での重なりを比較することで確認できます。

高平均出力のレーザー光にさらされるとサンプルが損傷する可能性があるため、3つの合成ビームはパルスピッカーとして機能する電気光学変調器を通過させます。これにより、サンプルに到達するパルスの繰り返し周波数、すなわち平均出力を調整することが可能です。次に、合成されたレーザービームを、高開口数（NA）の対物レンズを備えた倒立顕微鏡に導入します。高NA対物レンズによる鋭い集光により、微小領域においてコヒーレント・ラマン信号を極めて効率的に生成することができます。

顕微鏡の大物対物レンズはX、Y、Zピエゾステージに搭載されており、市販のビームスキャン共焦点顕微鏡と同様に、ビームをサンプル上でラスタースキャンすることで画像を取得できます。次に、CARSおよびDRFM信号の生成方法について説明します。サンプルにおける3本の短パルスレーザービームの相互作用により、2本のレーザーのさまざまな組み合わせによるCARSなどの複数の四光波混合信号に加えて、3本すべてのレーザーの組み合わせによる3色CARSおよびDR-CARS信号が生成されます。信号の波長が比較的近い場合、分析のためにそれらを分離することが困難な場合があります。

このような理由から、信号はイメージング分光計に送られます。この装置はモノクロメーターまたはバンドパスフィルターとしても機能し、異なる波長の信号を空間的に分離します。分光計内部にある電子駆動のフリップミラーを下げた位置にすると、信号は背面照射型ディープデプレッション電荷結合素子（CCD）カメラに送られます。これにより、信号範囲全体の分光情報が得られ、さまざまなコヒーレント反響信号を特定および最適化して、イメージングする信号を選択することが可能になります。ベンダー提供の制御およびデータ収集ソフトウェアを使用して分光計内のグレーティングを回転させ、目的のピークをCCDカメラの中心に合わせるだけで設定が完了します。

次に、フリップミラーの位置を変更して、信号を2つ目の出力ポートへ誘導します。ここには単一光子計数アバランシェフォトダイオード（APD）またはフォトダイオード（PD）が接続されています。対物レンズをラスタースキャンし、APDで記録された信号を用いて、データ収集ソフトウェアで各ピクセルの光子計数率を表示させ、画像を生成します。このイメージング手順を、目的とする各コヒーレント・ラマン信号について繰り返し、後処理で信号を比較できるようにします。

では、鮮明で再現性のある画像を得るための適切なサンプル調製方法について見ていきましょう。サンプルの調製には細心の注意が必要です。通常、サンプルは約150 µm厚のガラスカバースリップ上に調製します。

これらのカバーガラスは十分に薄いため、本実験で使用される高NAの水浸または油浸対物レンズを用いた高解像度イメージングが可能です。典型的なサンプルの調製を示すため、顕微鏡スライドに固定した約20 µm厚のマウス筋肉組織切片を用意します。サンプルの上に、5 Mの重水素化グルコース溶液を20 µL滴下します。

重水素化グルコース溶液は、特有の強力なラメン背景シグナルを提供します。サンプルの上にガラスカバースリップを配置し、細胞および培養用のマニキュアで固定します。ガラス底培養皿を使用すれば、細胞を培養皿から剥離させることなくイメージングが可能です。

それでは、Dr carsにおける適切なラマンピークの決定方法について見ていきましょう。二重共鳴増強効果を適切に利用するためには、両方のラマン共鳴物質のラマンスペクトルを知る必要があります。通常、これらは脂質に関連する2,845 cm⁻¹と、重水素化グルコースに関連するCD伸縮モードの2,121 cm⁻¹です。

コヒーレント・ラマン散乱は、2つのレーザーの周波数差が分子振動の周波数と一致したときに達成されます。一方のOPOを817 nmに調整すると、1064 nmのレーザービームと組み合わせて2,845 cm⁻¹のCモードをプローブし、もう一方のOPOを868 nmに調整すると、1064 nmのビームと組み合わせて2,121 cm⁻¹をプローブします。分光モードにおいて、顕微鏡を用いることで、注目すべき3つのコヒーレント・ラマン信号、すなわちCH伸縮振動をプローブするCAR信号、CD伸縮モードをプローブするCAR信号、およびその両方をプローブするDR-CAR信号を観察することが可能です。ここに示す図において、破線矢印はOPOからのレーザー光子を、実線矢印は得られた信号を示しています。

実線の水平線はラマン振動のエネルギーを示しており、DRカーでは、同じ3つの入力光子を同時に混合することで、2つの異なるラマン振動を同時にプローブできることを視覚的に表しています。各ピークの信号強度は、これらのピーク位置周辺で微調整を行うことで最適化する必要があります。ここでは、各ピークを選択し、脱糖グルコース溶液中のセイウミムシの画像を撮影します。これら個別に得られた3枚の画像に基づいて追加情報を抽出するには、非常に単純な画像処理が必要です。

まず、画像を正規化する必要があります。正規化の実用的な手法は、脂質が疎水性であるという事実に依拠しています。これは、脂質が高密度に存在する領域では、グルコースからのCD共鳴が二重共鳴信号にほとんど寄与しないことを意味します。

逆に、純粋なグルコース溶液の領域では、脂質由来のCH共鳴の寄与も非常に小さくなるはずです。これを踏まえ、DRカーの画像と、重水素化グルコース溶液のCD共鳴で得られたカーの画像を、CH共鳴を示さないはずのCL egan's wormの十分外側の領域で正規化します。次に、CH共鳴カー画像内で脂質が豊富なworm内部の領域を特定し、それを正規化済みDRカー画像の対応する領域で正規化します。

この手法を適切に機能させるために、この領域の深部には重水素化グルコースが存在しないと想定します。脂質は疎水性であり、溶液と混ざり合わないため、これは妥当な想定です。次に、規格化されたDR car画像から規格化されたCH共鳴car画像を差し引くことで、増幅されたCD共鳴信号のみが残ります。同様に、規格化されたDr.FWM画像から規格化されたCD共鳴car画像を差し引くことで抽出が可能です。

増幅されたCH共鳴信号のみが表示されています。ここに示されているのは、アルキン修飾を含む修飾オレイン酸のラマンスペクトルです。2,845 cm⁻¹の強いCH共鳴と2,121 cm⁻¹のアルキン共鳴は、どちらもピークが密集する指紋領域から十分に離れており、コヒーレント・ラマンイメージングの理想的なマーカーとなります。これは、3本の短パルスレーザーを試料内で重ね合わせた際に生成される、典型的なコヒーレント・ラマン信号のスペクトルです。矢印は、エネルギー図で示される各信号の原因となるプロセスを指しています。

これらは、DR CARSおよびCARSを用いてC. elegansをイメージングした際の代表的な結果です。最上段では、先ほど示した3つの信号を用いて、脱糖グルコース溶液中の線虫をイメージングしています。2段目の画像は適切に正規化されており、3段目の差分画像は、DR CARSの画像からCARSの各画像を差し引くことで作成されました。以上で、二重共鳴コヒーレント反ストークス・ラマン顕微鏡法に基づいたラマン差分イメージングの実行方法を説明しました。

この手順を行う際は、ビームが適切にオーバーラップし、同期していることを確認することが重要です。また、異なるコヒーレント信号を切り替える際は、分析に影響が出るため、サンプルにぶつかったり動かしたりしないように注意してください。以上です。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。