二重共鳴コヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）と生物学的構造の差イメージング

このビデオでは、コヒーレントなラーメン散乱信号を用いて、生体構造に関連する2つのラーメン共鳴をディファレンシャルイメージングする手順を示しています。最初の3つの同期した短パルスレーザーは、時間と空間で重なり合っています。重なり合ったパルスは、標準的な倒立顕微鏡に送られ、微視的な物体からコヒーレントなラーメン信号を生成することができます。

信号は、生成されるさまざまなラーメン信号を比較するために、商用ソフトウェアを使用して画像に変換されます。結果は、二重共鳴ラーメン信号と単一共振ラーメン信号から得られる画像間の差が、弱いラーメン信号に対する感度を高めることを示しています。こんにちは、カリフォルニア大学デービス校バイオフォトニクスセンターのタイラー・ウィーク

カリフォルニア大学デービス校のバイオフォトニクスセンターおよび内科のトーマスERです。今日は、二重共鳴コヒーレント抗ストークスラーメン散乱を使用して、細胞の化学的に特異的な画像を生成する手順を紹介します。この手順を使用して、コヒーレントアンチストークスストークスラモン分光法だけでは直接検出できない弱すぎる分子からのシグナルを検出します。

では、車とDrの車が同時に信号を生成するためには、これらの同期パルスを得るために、3つの調整可能な同期された短パルスレーザー光源が必要です。出力電力が10ワットの1つの短パルスレーザーから始めます。1064ナノメートルの固定波長、7ピコ秒の固定パルス長、76メガヘルツの固定繰り返し周波数。

一連の半波長板と偏光ビームスプリッターキューブを使用して、ビームは3つの部分に分割されます。ハーフウェイプレートと偏光ビームスプリッターキューブを組み合わせることで、ビームの各コンポーネントのパワー量を方向を変えることなく調整できます。通常、2 つのビームはそれぞれ約 4.5 ワットに調整され、3 番目のビームには残りの 1 ワットが含まれます。

次に、2つの高出力ビームは、2つの独立した光パラメトリック発振器またはOPOに向けられます。OPOは、異なる周波数生成を使用して、高エネルギー光子を異なる波長の2つの低エネルギー光子に変換します。この効果を達成するために使用される結晶の温度を制御することにより、得られる光子の波長を0.1ナノメートル以内に制御できます。

これらの信号を周波数を2倍にすることで、1064ナノメートルの固定波長のレーザーを、同じ1064ナノメートルの光源を持つ2つの別々のOPOをポンピングすることにより、780ナノメートルから910ナノメートルの間の任意の場所に調整できるレーザービームに変換できるようになりました。2つの独立して調整可能なレーザー光源が得られ、それらは自動的に当社のオリジナルポンプレーザーに同期されます。1064ナノメートルのポンプレーザーからの3番目のビームは、誘電体ミラーの組み合わせによってOPOの周囲に向けられ、3つのビームすべてを後で再結合することができます。

コヒーレントなラーメン信号光子を効率的に生成するためには、OPOにはリングキャビティがあり、各レーザーパルスが結晶を複数回通過することを可能にするため、再結合されたパルスを時間的および空間的に重ね合わせる必要があります。この距離は、パスの長さを微調整するために、ダイクロイックミラーを使用して再結合される前に、このビームが他の2つのビームと同じ距離を移動するように強制する追加のミラーを導入することにより、3番目のビームで補正する必要があります。各ビームは調整可能な遅延ステージを介して送信され、異なるレーザーパルスの時間的オーバーラップを調整できます。

各ビームには、ハーフウェイプレートと偏光ビームスプリッターキューブの別のセットが追加され、各ビームのレーザー出力を個別に調整できます。ダイクロイックミラーは、最初に2つのOPOからのビームを組み合わせるために使用され、次に1064ナノメートルのビームに注意を払い、ビームが空間内で正確に重なるようにする必要があります。これは、ダイクロイックミラーから数cm以内のビームとダイクロイックミラーから約1mのビームの重なりを比較することで確認できます。

高平均出力のレーザービームにさらされるとサンプルが損傷する可能性があるため、3つの結合されたビームは、パルスピッカーとして機能する電気光学変調器を介して送信され、サンプルに到達するパルスの繰り返し率、したがって平均出力を調整できます。次に、結合されたレーザービームは、高開口数またはnaの対物レンズを備えた倒立顕微鏡に結合されます。高NA対物レンズによるタイトなピント合わせにより、顕微鏡の長さスケールでコヒーレントなラーメン信号を最も効率的に生成することができます。

顕微鏡の対物レンズはX、Y、Zピゾステージに取り付けられており、市販のビームスキャン、共焦点顕微鏡と同様に、サンプル全体のビームをラスタースキャンすることで画像を取得できます。次に、車とD-R-F-W-M信号を生成する方法を見てみましょうサンプルでは、3つの短いパルスレーザービームの相互作用により、2つのレーザーのさまざまな組み合わせから車などのいくつかの4波混合信号が生成され、3つのレーザーすべての組み合わせから3色の車とDR車の信号が生成されます。信号の波長が比較的近い場合、解析のために信号を分離するのが難しくなる可能性があります。

このため、信号は、モノクロメーターまたはバンドパスフィルターとしても機能するイメージング分光器に渡され、異なる波長の信号を空間的に分離します。下降位置にある分光器内の電子的に作動するフリップミラーは、信号を背面照射型深部枯渇電荷結合装置またはCCDカメラに送信し、信号範囲全体にわたる分光情報を提供し、さまざまなコヒーレントロビン信号を特定して最適化し、イメージングする信号を選択することを可能にします。ベンダーが提供する制御およびデータ収集ソフトウェアを使用して、分光計内でグレーディングを回転させるだけで、対象のピークをCCDカメラの中央に配置できます。

次に、フリップミラーの位置を変更して、アバランチ写真DDEまたはPDをカウントする単一光子が接続されている2番目の出口ポートに信号をリダイレクトします。ラスター。対物レンズを走査し、A PDに記録された信号を用いて、データ取得ソフトウェアで各画素の光子計数率を表示し、画像を生成します。必要なコヒーレントラーメン信号ごとにこのイメージング手順を繰り返して、後処理中に信号を比較できるようにします。

それでは、鮮明で再現性のある画像を取得するために、サンプルを適切に調製する方法を見てみましょう。サンプルの準備にはいくつかの注意が必要です。サンプルは通常、厚さ約150ミクロンのガラスカバースリップに調製されます。

これらのカバースリップは、これらの実験で使用される高NA水または油浸対物レンズによる高解像度イメージングを可能にするのに十分な薄さです。典型的なサンプルの調製を実証するために、顕微鏡スライドに固定されたマウス筋肉組織の厚さ約20ミクロンの切片を調製します。5モルの重水素化グルコース溶液の20マイクロリットルの液滴をサンプルに加えます。

重水素化グルコース溶液は、ユニークで強力なラーメンの背景シグネチャーを提供します。ガラスカバースリップをサンプルの上に置き、細胞と培養用のマニキュアで所定の位置に固定します。ガラス底培養皿は、細胞培養増殖皿から細胞を切り離すことなくイメージングを可能にするために使用できます。

それでは、Drの車の適切なラム酒とピークを決定する方法を見てみましょう。二重共振増強効果を適切に活用するためには、両方のラーメン共鳴物質のラーメンスペクトルを知る必要があります。典型的には、これらは脂質に関連する2, 845逆センチメートルであり、重水素化グルコースに関連するCDストレッチモードのための2, 121逆センチメートルである。

コヒーレントラーメン散乱は、2つのレーザ間の周波数差が分子振動の周波数と一致する場合に達成されます。1つのOPOを817ナノメートルに調整することにより、1064ナノメートルのレーザービームと組み合わせたときに2, 845逆センチメートルCモードをプローブし、他のOPOを868ナノメートルに調整することにより、1064ナノメートルのビームと組み合わせたときに2, 121逆センチメートルをプローブします。分光モードでは、車の顕微鏡で、CHストレッチ振動をプローブする車信号、CDストレッチモードをプローブする車信号、およびDR車信号をプローブする3つのコヒーレントラーメン信号を観察できます。ここに示す図では、破線の矢印はOPOのレーザーからの光子を示し、実線の矢印は結果の信号を示します。

実線の水平線はラーメンの振動のエネルギーを示し、DRカーでは同じ3つの入力光子を同時に混合して2つの異なるラーメンの振動をプローブすることを視覚的に表現しています。各ピークの信号強度は、これらのピーク位置の周りで微調整して最適化する必要があります。ここでは、各ピークを選択し、ディレートされたグルコースの溶液中のウミエルカンミズの画像を撮影しますが、これら3つの個別に取得した画像に基づいて追加情報を抽出するには、かなり簡単な画像処理が必要です。

まず、画像を正規化する必要があります。正規化の実用的な方法は、脂質が疎水性であるという事実に依存しています。これは、高密度脂質の領域では、グルコースからのCD共鳴が二重共鳴シグナルにほとんど寄与しないことを意味します。

逆に、純粋なグルコース溶液の領域では、脂質からのCH共鳴もほとんど寄与しないはずです。このことを念頭に置いて、DR車のイメージと重水素化グルコース溶液のCD共鳴で得られた車のイメージを、CLイーガンワームのかなり外側の領域に正規化し、CH共鳴を示さないはずです。次に、CH 共鳴車画像内の線虫内で脂質が豊富な領域を特定し、正規化された DR 車画像内の対応する領域に正規化します。

この方法を適切に機能させるには、この領域の深部に重水素化グルコースが存在しないと仮定します。脂質は疎水性であり、溶液と混ざらないため、これは安全な仮定です。ここで、正規化されたDR車の画像から正規化されたCH共振車の画像を差し引くと、正規化されたDr.FWMの画像から正規化されたCD共振車の画像を差し引くと、増幅されたCD共振信号だけが同様に残ります。

ここに示されている増幅されたch共鳴信号だけが残っているのは、アルキン修飾を含む修飾オレイン酸のラーメンスペクトルであり、2, 845逆センチメートルの強いCH共鳴と2, 121逆センチメートルのアルパイン共鳴は、どちらも密集したピークの領域であるフィンガープリント領域から十分に分離されています。 コヒーレントなラーメンイメージングの理想的なマーカーとなっています。これは、サンプル内で3つの短パルスレーザーが重なったときに生成されるコヒーレントラーメン信号の典型的なスペクトルです。矢印は、エネルギー図で表される各信号を担当するプロセスを指しています。

これらは、DRカーとカーを使用してC Elginのワームをイメージングした典型的な結果です。一番上の行は、先ほど示した3つの信号を使用して、ディレートされたグルコースの溶液中の線虫を画像化しました。2行目では、画像が適切に正規化され、3行目では差分画像が生成されましたDR車の画像から車の各画像を差し引くことにより、二重共鳴コヒーレントラマンラマン顕微鏡法に基づいてラマン差分イメージングを実行する方法を示しました。

この手順を実行するときは、ビームが重なり合い、適切に同期していることを確認することが重要です。また、異なるコヒーレント信号を切り替えるときは、サンプルをぶつけたり動かしたりしないように注意してください。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。