活性骨髄由来マクロファージとBradyzoite条件におけるトキソプラズマのシスト壁形成

本手順の全体的な目的は、in vitro において Toxoplasma gondii のシスト壁形成を誘導し、可視化することです。これは、まずマクロファージと線維芽細胞を培養することによって達成されます。

次に、これらの宿主細胞に寄生虫を感染させ、pHによる線維芽細胞への刺激またはマクロファージの活性化によって、寄生虫にストレス応答を誘導します。これにより、いずれの場合もシスト壁が形成されます。最後に、シスト壁に結合する蛍光レクチンを培養液に添加し、免疫蛍光顕微鏡でシストを可視化します。こんにちは。ウィスコンシン大学マディソン校医学微生物学・免疫学部、Dr.Laura Noelの研究室のCrystal Tobinです。

No Labのアンジェラ・ポラードです。本日は、in vitroにおけるToxoplasma gondiiのシスト壁形成の手順について解説します。当研究室では、ストレス条件下における寄生虫の応答を研究するためにこの手法を用いています。

それでは、始めていきましょう。まず、24ウェル組織培養プレートの各ウェルの底に、滅菌済みの円形ガラスカバースリップを配置します。これにより、高pHおよび二酸化炭素飢餓条件下で、ヒト前皮線維芽細胞におけるToxoplasma gondiiのブラディゾイトへの分化を誘導します。組織培養用フード内で、コンフルエントになった150 cm²フラスコのヒト前皮線維芽細胞から開始してください。

コンフルエントになったヒト包皮線維芽細胞のフラスコを1xPBSで2回洗浄し、0.025%トリプシンEDTAを2.5 mL加えます。フラスコを37 °Cで5〜10分間インキュベートします。5〜10分間のインキュベーション後、フラスコを数回軽く叩き、プラスチック表面から細胞を遊離させます。

次に、150 millilitersのHFF培地またはサプリメント添加delcos modified eagles mediumを加えます。この培地を用いてフラスコを洗浄し、細胞を回収します。カバーガラスを入れた24 well plateの各ウェルに細胞を1 milliliterずつ分注し、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で細胞をコンフルエントになるまで培養します。

これで細胞はToxoplasma Gandhi寄生虫を感染させる準備が整いました。ティッシュカルチャーフード内で、コンフルエント状態になった25 square centimeterのフラスコ内のヒト包皮線維芽細胞に2×10⁶個の寄生虫を感染させ、細胞が溶解し始めるまで37 °Cでインキュベートします。約2〜3日後、セルスクレイパーを使用して、ティッシュカルチャーフラスコから感染した包皮線維芽細胞の単層を除去します。

次に、剥離させた単層を27ゲージの針に通して、宿主細胞から寄生虫を放出させます。血球計数器を用いて培地中の寄生虫数を算出し、あらかじめ準備しておいたコンフルエントなヒト前皮線維芽細胞の24ウェルそれぞれに、10⁵個の寄生虫を感染させます。

寄生虫が宿主細胞に侵入するように、細胞を37°C、5% carbon dioxideで3時間インキュベートします。次に、寄生虫をBrady Zeolite期へ分化誘導します。感染させたヒト前皮線維芽細胞からDMEMを除去します。

それらを1回XPBSで洗浄し、次いで1 mLの発色培地を添加します。これは、pH 8に調整した重炭酸塩を含まないRPMIベースの培地です。細胞を37 °Cの室温空気下で3日間インキュベートします。

これで、細胞中のBradyzoitesの有無を解析する準備が整いました。Bradyzoitesの存在は、Toxoplasma gondiiのシスト壁に結合する蛍光標識レクチンのDolichos biflorus agglutinin（DBA）を用いて判定します。蛍光イメージングに向けて感染細胞を調製するため、ウェルを1×PBSで3回洗浄します。

次に、3% formaldehyde 200 µLを用いて細胞単層を20分間固定します。固定液を除去し、ウェルをXPBSで1回洗浄します。0.1 molar glycine 200 µLをウェルに加え、5分間静置します。

グリシンを除去し、ウェルをXPBSで1回洗浄して、細胞のブロッキングおよび透過処理を行います。ブロッキング溶液を250 µL加えます。細胞を30分間インキュベートします。

ブロッキング溶液を除去し、ウェルを1回XPBSで洗浄します。ルミン（rumine）を結合させたDBAの1/250希釈液を50 µL、各ウェルに加えます。プレートに蓋をし、室温でプラットフォームシェーカーを用いて1時間振盪します。

インキュベーション後、カバースリップを1×PBS中の0.2% Triton X 100で5分間ずつ3回、プラットフォームシェーカーを用いて洗浄し、蛍光標識されたDBAを除去します。最後に、DPIを含むBeta Shield封入剤を用いてカバースリップを封入します。染まった細胞は、ロダミンに適したフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて、100倍の倍率で観察できます。Brady ZO形成を誘導する代替法として、インターフェロンγおよびリポポリサッカライド（LPS）を用いて感染した骨髄由来マクロファージを活性化させる方法があります。まず、このプロセスのためにL 929コンディショニング培地を調製します。

L 9 29は、長期間のコンフルエンス後にマクロファージコロニー刺激因子を分泌する、応用線維肉腫細胞株である。この条件化培地は、細胞培養においてマウス骨髄細胞をマクロファージへと分化させるために使用できる。条件化培地を調製するには、L 9 2 9細胞を150 cm²のフラスコで37 °Cでコンフルエンスまで増殖させる。その後、細胞が球状になり、フラスコの表面から剥離し始めるまで、さらに7〜9日間インキュベートする。

培地と剥離した細胞を50 mLチューブに回収し、420 ×gで10分間遠心分離します。得られた上清がコンディション培地となります。L 9 29細胞を播種した150 cm²フラスコ1本から30 mLのコンディション培地が得られ、これは150 mLのBMC培地を調製するのに必要な量です。BMC調製に使用するL 9 29細胞用のDMEMをあらかじめ準備しておくことを忘れないでください。

骨髄細胞の単離方法を詳しく示したビデオプロトコルを視聴してください。マウス大腿骨については、採取したBMCを5日間培養した後、以下のビデオプロトコルを視聴してください。細菌学用ペトリ皿に、L 9 2 9細胞の条件付き培地を含むBMC培地を10 millilitersずつ加え、さらに2日間培養すると、細胞が完全に分化します。

成熟した骨髄由来マクロファージ（BMS）は、成熟後1〜2週間にわたって継代することが可能です。BMSを分離させるため、培地を除去し、4°Cでインキュベートした冷たい1×PBSを5mL加え、細胞が剥がれ始めるまで30分間放置します。滅菌転送ピペットを用いて、プレートから細胞を洗い流します。BMSを50mLコニカルチューブに移し、420 ×gで10分間遠心して細胞をペレット化します。

ペレットを10 millilitersのBMC培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞密度を測定します。24ウェルプレートの底面にラウンドカバーガラスを配置し、1ウェルあたり2×10⁵個のBMSを播種します。T. gondiiを感染させる前に、一晩置いて細胞を接着させます。

余剰の細胞は、後で使用するためにペトリ皿で保存することができます。BMSを活性化させるために、活性化培地を調製します。凝集物を解消するため、LPSをウォーターバスで2分間超音波処理します。その後、BMC培地に100 nanograms per milliliterのLPSと100 units per milliliterのIFN gammaを添加します。

最後に、ウェルからBMC培地を除去し、活性化培地に交換します。37°C、5% carbon dioxideで3日間インキュベートします。BMCの染色は、以前に前皮線維芽細胞で示された方法で行うことができます。

これらの例では、ヒト包皮線維芽細胞におけるtoxoplasma Gandhi I Bradysが蛍光DBAで標識されています。pHストレス下において。このin vitroシストの断面図に示されるように、IFN GammaおよびL-P-S-D-V-Aで活性化されたdmsにおけるシスト壁が蛍光標識されています。

ここに見られるように、空胞の表面にも染色が認められます。以上で、線維芽細胞および活性化マクロファージ内にあるin vitroのToxoplasma gondiiシストの染色方法を説明しました。この手順を行う際は、寄生虫と宿主細胞が同じ日に準備できるよう計画を立てることが重要です。

以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。