Name: マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: 学ぶマウス膵島の単離と被膜下腎移植の方法。酵素消化による膵島採取と腎臓被膜下への移植手技を解説し、血糖値モニタリングで移植機能を評価する技術を習得できる。

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<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
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<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
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<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

上記のセクションでは、我々はマウスの膵島を分離して移植するための詳細な手順を説明した。ここで、我々は、簡単に手続きの成功にとって重要なステップを強調表示します。 1。膵島の分離重要なステップは37の後に総胆管（2.3）、膵臓の激しい振動をcannulating、総胆管（2.2.3）の十二指腸開口部に止血クランプを配置、最適な酵素消化の時間（1.4）を識別している° Cダイジェスト（3.2）、および外分泌細胞の汚染の除去（3.3.7と3.3.16）。これらの手順は、膵島の品質、収量や純度に劇的な影響を与える。おそらく、最も技術的に困難なステップは、総胆管のカニューレです。多くのマウスでは、総胆管は、周囲の筋膜による可視化が困難になる可能性があります。したがって、試行が唯一の筋膜組織の浸透の総胆管の結果をカニューレを挿入するためにするのが一般的である。これらのインスタンスでは、リベラーゼは周囲の結合組織を埋めるために開始され、膵臓を灌流していません。これが認められる場合は、リベラーゼの流れを停止し、それが胆管の内腔に浸透するように針の位置を変更。練習すれば、それはすぐに針を配置するための最適な位置を特定し、砕けやすいのダクトに損傷を与えることなく、カニュレーションを完了することが可能です。 2。膵島移植重要なステップは、糖尿病（5.1）のSTZ誘導及び被膜下のポーチ（5.3.14-5.3.16）に膵島の効率的な配信です。 STZは、インスリン分泌細胞膵島9のβ-細胞に選択的に毒性が、天然に存在するグルコースのアナログです。しかし、この選択毒性は比較的狭い濃度範囲で発生します。これは、STZの高用量は、高血糖の存在下で急速な（2-3日）致死性をもたらすことができるという事実によって証明されています。したがって、任意の大規模な実験が開始される前に使用されているマウスの系統および年齢のためにSTZの最適な用量を識別するために注意すべきである。嚢下ポーチに小島の物理的なデリバリーも重要なステップです。一貫性のある結果を達成するために、それは彼らの配達中に膵島の損失を最小限に抑えることが不可欠です。ポーチをカバーする腎臓被膜の欠陥や涙があるかどうか注入量が大きすぎる場合に発生する可能性があります。カプセルの損傷は、と嚢下袋を準備するために滑らかなガラスのプローブを使用して穏やか、慎重に操作することで回避できます。さらに、注入量は、ステップ5.3.6.3の上清を注意深く除去して最小限に抑えることができます。上清を沈降した膵島のレベルにまで除去されている場合は、通常は400から500膵島を配置する嚢下ポーチ内に十分なスペースよりももっとあります。しかし、注入量が大きすぎると、小島は、実験の再現性を犠牲にすること、移植の過程でポーチから漏れやすくなります。 このプロトコルでは、それは手順の一部を変更しても、満足できる成果を達成することが可能です。これらは、次のとおりです（a）の膵臓を消化するためにさまざまな酵素の使用、膵臓に酵素を提供するため（b）の別の方法、（c）の連続フィコール - ナトリウム - ジアトリゾエート（FSD）のグラデ​​ーションの使用代わりに、単一の密度Histopaque1077ステップ、および腎臓の被膜下以外の場所から（d）膵島移植の。 <ol class="lalpha"><li>このプロトコルでは、リベラーゼは、膵臓内の細胞間接触を弱めるために使用されます。リベラーゼは、本質的に非常に膵臓から膵島を放出に有用な証明されているコラゲナーゼを精製の混合物である。しかし、あまり精製されたコラゲナーゼは、同様の結果を達成することが可能です。したがって、消化の条件は、高膵島品質、収量と純度を達成するために最適化されている限り、膵臓を消化するために別の市販の酵素製剤を使用することが可能です。 </li><li>それは酵素の膵管灌流することなく膵臓を消化することも可能です。総胆管を通じてリベラーゼの配信は、酵素の膵臓の表面積の最大露出することができます。膵臓と無傷の島の大放出のより均一な消化でこの結果。しかし、酵素に膵臓の表面積を増やすために他の手順を使用することができます。例えば、リベラーゼでそれをインキュベートまたは直接膵臓のカプセルを通じてリベラーゼを注入する前に刻む膵臓は、膵島を分離するために使用することができます。しかし、リベラーゼの配信の他の方法では、総胆管を介して灌流と同程度に有効ではありません。したがって、ミンチまたは直接注入は、総胆管が破損しperfusableされていない場合は、最後の手段として確保しておく必要があります。 </li><li>外分泌細胞から膵島を分離するための代替方法が含まれますHistopaque1077 10の代わりにFSDのグラデーションを使用してください。このプロトコルの外分泌細胞からの膵島の効率的な分離は、部分的に2種類の細胞型との間の密度差によるものです。 Histopaque1077は25 1.0771グラム/ mlの密度℃である。この温度で​​は、Histopaqueは外分泌細胞より小さく密度の高い島よりも密度が高いですが。したがって、遠心分離、Histopaque1077ペレット外分泌細胞の力で表面に膵島を持ち上げながら。原則として、外分泌細胞から膵島を分離できることを密度と他の物質は、このステップで使用され、FSD勾配は、そのような物質であることができる。 </li><li>膵島移植のための場所に関しては、このプロトコルで使用される腎臓被膜は、いくつかの候補地の一つです。腎臓の被膜下にマウスの移植の最も一般的に報告のサイトですが、他の移植サイトが有効であることが明らかに、彼らは肝門脈、網膜下腔、精巣、精巣上体脂肪パッド、脾臓、さらに膵臓11-14を含んされています。これらの場所のそれぞれにはそれぞれ利点と課題があります。したがって、膵島移植のためのサイトの選択は、実験の対処の質問および特定の状況によって決定されるべきである。 </li></ol>それは、膵島移植の制限を克服することができる戦略は劇的にその治療の可能性を高めると考えられています。したがって、このプロトコルで詳述するようにマウスモデルを使用すると、そのような戦略を特定するための魅力的なアプローチを提供しています。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>試薬</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>試薬</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトゾトシン</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>試薬</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>試薬</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>インスリン用注射器</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>27ゲージ注射針</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton シリンジ #1702</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>10cm ペトリ皿</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>6cm ペトリ皿</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>6-0 縫合糸</td><td>器具</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 フレキシブルチューブ</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>5ml 使い捨て注射器</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>50ml コニカルチューブ</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15ml コニカルチューブ</td><td>器具</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>0.1mm ナイロンメッシュ</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.419mm ワイヤーメッシュ</td><td>器具</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>恒温水槽</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>器具</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>器具</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>器具</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>解剖用鋏</td><td>器具</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 鋏</td><td>器具</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>曲鉗子</td><td>器具</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>器具</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>イソフルランネブライザー</td><td>器具</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット遠心機</td><td>器具</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター</td><td>器具</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>器具</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>ゲルロード用チップ</td><td>器具</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>p200 チップ</td><td>器具</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

糖尿病のげっ歯類へのランゲルハンス島の移植は、血液中の血糖値を正常化することができることを実証バリンジャーとReckardの初期の先駆的な仕事以来、膵島移植は1型糖尿病の1,2の治療薬であることが提案されている。さらに最近では、人間の膵島移植の進歩は、さらにこのビュー1,3を強化している。しかし、2つの大きな制約は、広範な臨床的現実であることから、膵島移植を防ぐ：著しく影響を及ぼす深刻な潜在的な受信者の数を減らし、患者あたりの小島、多数のための（a）の要件、および重い免疫抑制のための（b）の必要性、長期の免疫抑制への脆弱性に起因する患者の小児集団。これらの制限を克服することができる戦略は、膵島移植の治療的有用性を高める可能性を秘めている。 マウスの腎被膜下膵島移植は膵島移植を向上させるために様々な戦略を調査するために広く受け入れられているモデルです。この実験は、高品質の小島と糖尿病の受信者への膵島移植の分離が必要です。両方の手順は、より良いテキストではなく映像によって示すことができる外科手術手順を実行する必要があります。ここでは、ビデオと書かれたプロトコルの両方でこれらの手順の詳細な手順を文書化します。我々はまた、簡単に別の移植モデルを説明します。同系、同種、同系自己免疫、自己免疫同種。

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。

糖尿病の齧歯類にランゲルハンス島を移植することで血糖値が正常化することを実証したBallingerとReckardによる初期の先駆的な研究以来、...

膵島移植は、1型糖尿病の潜在的な治療法として提案されています。しかし、広範な臨床応用を実現する上で2つの大きな制限があります。第一に、レシピエント1人あたりに大量の膵島が必要となることです。アイレットは臓器ドナーから提供されるため、潜在的なレシピエントの数は極めて限定的です。2度目の移植には強力な免疫抑制剤による生涯にわたる治療が必要であり、これは患者、特に小児集団において、悪性腫瘍、感染症、および腎不全のリスクを伴います。臨床的な移植成績を向上させるための戦略を研究するため、マウス腎被膜下へのアイレット移植が行われます。健康なドナーマウスから分離したアイレットをグループ分けし、移植の準備を行います。その後、アイレットを腎臓の被包下に移植します。糖尿病のレシピエントマウスにおけるアイレット移植片の機能は、血糖値のモニタリングによって評価されます。その結果、20 gのレシピエントマウスにおいて、約250から350個のアイレットを移植すれば、24時間以内に血糖値が正常に回復することが明らかになります。カニューレ挿入の手順において、この手法を視覚的に提示することは極めて重要です。総胆管への挿入およびアイレットの腎被膜下腔への移行は、習得が困難な操作です。これらのステップでは、組織構造の正確な識別、安定した手技、および組織損傷を最小限に抑えるテクニックの使用が求められます。安楽死させたマウスを解剖顕微鏡下のペーパータオルの上に仰向けに置き、腹部に70% ethanolをスプレーします。ハサミを使用して、恥骨領域から両前肢にかけてV字に切開し、腹部を開きます。マウスは解剖顕微鏡の下に配置されています。頭部が観察者側に向くように配置します。止血鉗子を用いて、総胆管の十二指腸への流入部、すなわち総胆管の十二指腸開口部を特定します。止血鉗子は、閉じた際に膵臓と腸の境界に正確に沿うように配置してください。ここでは、胆管をカニュレーションする2つの方法を実演します。胆管をカニュレーションするためのフリーハンド法と、鉗子補助法です。フリーハンド法を用いる場合は、十二指腸にクランプした止血鉗子を、マウスの頭側から尾側へ引き、総胆管を緊張させます。肝臓に近い胆管には、胆嚢から排出される胆汁と肝臓からの酵素が合流する部位があります。腸に入る前に、胆管を強く引っ張り、V字部位の内側を露出させます。5 mLのシリンジに取り付けた曲げた27ゲージの針を使用し、針をV字部分に沿わせて滑り込ませ、胆管の下部を直接カニューレします。肝臓や胆嚢への逆流を防ぐため、針を刃先の先端から数mm先まで挿入してください。カニュレーションが成功したら、シリンジから2 mLのliaseを注入して膵臓を灌流させます。膵臓が胃の上で膨張することを確認し、カニュレーションが最適に行われたか判断します。あるいは、胆管をカニュレーションすることも可能です。鉗子嚢胞法を用います。十二指腸に固定した止血鉗子Cを、マウスの頭側から尾側に向かって引き、総胆管を屈曲させます。次に、5mLシリンジに取り付けた曲げた27ゲージの針を用いて、肝臓に近い総胆管下の筋膜を穿刺します。針を刺したまま、針を用いて管から筋膜を取り除きます。止血鉗子を置き、ピンセットを持ちます。ピンセットを開いた状態で、片方の先端で針によって筋膜が取り除かれた胆管を支持しながら、胆管とピンセットを前方へ牽引します。ピンセットを背後のストッパーとして利用し、針を管の中に滑り込ませます。胃の上の膵臓領域が均一に拡張していれば、カニューレ挿入が成功したことを示しています。膵臓への灌流が完了したら、十二指腸から止血鉗子を取り除きます。次に、ピンセットで十二指腸を持ち上げ、もう一本のピンセットを使用して膵臓を腸から分離します。続いて、膵臓を胃の上部および脾臓から引き離します。最後に、膵臓を腹腔内から持ち上げ、腸、胃、および脾臓に残っている筋膜の結合部を切断して取り出します。膵臓を50 mLのコニカルチューブに入れ、氷上に置きます。付属の書面プロトコルの指示に従い、膵臓を37 °Cでインキュベートします。インキュベーション後、チューブに20 mLの培地を加え、チューブを10秒間に40回激しく振ることで組織を解離させます。このステップは、バイオレットを最適に回収するために極めて重要です。細胞を800 rpmで遠心分離します。15 mLの培地で再懸濁し、サンプルを濃縮します。再懸濁したスラリーを0.419 millimeterのワイヤーメッシュに通し、新しい50 milliliterコニカルチューブにろ過します。最初のチューブを10% fetal bovine serumを含む培地10 millilitersで洗浄し、同様にワイヤーメッシュに通します。遠心分離により細胞をペレット化し、室温のHistopaque 1077 5 millilitersでペレットを再懸濁します。その後、数秒間緩やかにボルテックスし、さらに5 millilitersのHistopaqueを追加し、チューブの内壁に付着した細胞を洗い流します。血清不含RPMI 10 millilitersを、10秒あたり1 milliliterの速度でチューブの壁面に沿ってゆっくりとピペッティングし、オーバーレイします。明確な界面が確認できるはずです。次に、スイングバケット式遠心機を用い、20 °C、900 ×g で20分間、加速を非常に緩やかにし、遠心後ブレーキをかけずに回転させます。遠心後、使い捨ての 10 mL セロロジカルピペットを使用して、膵島を外分泌細胞から分離します。HistoPaque 培地の界面から膵島を回収し、新しい 50 mL コニカルチューブに移します。この時点で複数のチューブをまとめ、残留した眼窩組織を除去します。血清含有培地で不透明なチューブを満たし、800 rpmで2分間遠心分離してアイレットをペレット化します。その後、アイレットを新鮮な培地で再懸濁します。この手順を少なくとも2回繰り返します。ペレットを5 mLの培地に懸濁させる。0.1 mmのナイロンセルストレーナーを15 mLコニカルチューブの上に逆さまに設置する。再懸濁した細胞スラリーをストレーナーに通して、アイレットを回収する。次に、50 mLチューブをさらに6 mLの培地で洗浄し、ストレーナーに通します。10 cmペトリ皿に培地を3 mL滴下します。セルストレーナーを逆さまにして培地の滴に浸し、アイレットを回収します。さらに5〜7 mLの培養液をストレーナー経由でペトリ皿にピペッティングします。4倍対物レンズ下でストレーナーに残っているアイレットを回収するため、P 200ピペットでアイレットを個別に吸い上げ、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。これらの画像は、12週齢のC 57black/6マウスから単離したアイレットを示しています。単離手順の完了後、顕微鏡下でアイレットの純度と品質を推定することができます。例えば、ここに示す2つの画像は、デブリや外分泌細胞の混入がある代表的な視野を示しています。実験用のアイレットを選択する際は、混入している外分泌細胞や、不健康に見えるアイレットを避けて選択してください。分離から24時間後に撮影したこの図に示すように、中心部が壊死しているアイレットは不健康な状態ですが、壊死した中心部は分離直後には確認できません。細胞が脱落しているアイレットは避けられませんが、このアイレットの24時間タイムラプス動画に示すように、アイレット移植に使用することが可能です。単離直後、多くのアイレット内で壊死中心が形成されます。アイレットをピッキングしている際、記録の終盤に向けて、これらの壊死中心がアイレットから排出される様子が見られます。各チューブにアイレットの品質とサイズが均等に分散するようにグループ分けします。例えば、15個のアイレットの各グループに、大サイズを4個、中サイズを6個、小サイズを5個含めるようにします。チューブを氷上に置き、アイレットを直ちに移植に使用するか、あるいは操作に用います。使用前に、滅菌済みのゲルローディングチップを1.5 mLマイクロチューブの開口部に挿入します。この際、チップの狭い端が緩やかに曲がり、U字型になるようにしてください。チップの両方の開口部が、マイクロチューブから直接上を向いている必要があります。氷からアイレットが入ったチューブをゆっくりと取り出します。すべてのアイレットがチューブの底に沈んでいることを確認してください。P 200 ピペットを使用して、チューブの底から最小限の量でアイレットを静かに回収し、用意した曲がりチップに転送します。アイレットが沈降した後、アイレットが入ったゲルローディングチップの広い開口部から培地を吸引し、チップ先端から可能な限り多くの培地を除去します。この際、P 200 ピペットに新しいゲルローディングチップを取り付けて使用してください。チューブの面取りされていない端を、アイレットが入ったゲルローディングチップの狭い開口部に接続します。その後、チップを P 200 ピペットに取り付け、アイレットをチューブの中にゆっくりと押し出します。次に、PE 50チューブの面取りされていない端を、25 µLのハミルトンシリンジの針に接続します。プランジャーを引き出した状態で、アイレットが面取りされた開口部から約0.5 cm離れるまで、シリンジのプランジャーを押します。腎臓にアイレットを導入する準備が整うまで、アイレットがチューブの面取り開口部付近で一つの塊として落ち着くように、シリンジを置いておきます。被毛をクリッピングし、ベタジンと70% isopropyl alcoholを交互に3回使用して皮膚を洗浄し、手術部位を準備します。レシピエントマウスの足指を挟んで麻酔状態を確認し、アイレット移植の手順を開始します。ガラス棒のシャフトをマウスの直下、脊髄に対して垂直かつ腎臓の下に配置します。次に、皮膚越しに腎臓の位置を確認し、滅菌手術用ドレープを掛けます。腎臓の位置を特定した後、McFerson banis 鋏を用いて、腎臓の直上の真皮を脊髄に対して垂直に 2 cm 切開します。この切開により、鋏で腹膜壁が露出します。ガラス棒のシャフトを支えにして、皮膚層の切開と同じ方向に腹膜壁を1cm切開します。隣接する表面を押し下げ、腹膜の開口部から腎臓を押し出します。浸した綿棒を用いて、露出した腎臓の表面を氷冷滅菌PBSで湿らせます。腎被膜の乾燥を防ぐため、必要に応じて数分ごとにこの操作を繰り返します。27ゲージの針を用い、腎臓前面の腎被膜に0.2 cmの切開を加えます。左外側から右外側に向かって、火炎延伸したガラスキャピラリーチューブを挿入します。先に作成した切開口からプローブし、腎臓の背外側表面に沿って後方に移動させます。腎被膜と腎実質の間にポーチを作成するため、準備した25 milliliterのHamiltonシリンジ内のアイレットを、フレキシブルチューブのベベル開口部の端まで移動させます。次に、ベベル端を上向きにして被膜下ポーチに挿入します。このとき、長い方の端が腎実質に接するようにします。チューブをカプセルの最も後方に移動させます。次に、シリンジのプランジャーを押し下げ、PE 50チューブからサブカプセルポーチへアイレットをゆっくりと移動させます。アイレットでポーチが満たされたら、よりスペースを確保するために、フレキシブルチューブをゆっくりと後退させます。ポーチからチューブを取り出した後、ガラスプローブを腎臓の外表面に沿って前から後ろへと滑らせ、アイレットをポーチの近位端に緩やかに詰め込みます。曲がり鉗子を用いて、腎臓のために作った開口部付近の腹膜を lifts します。次に、PBSに浸した綿棒を用いて、腎臓を腹腔内にゆっくりと押し戻します。腹壁を縫合し、皮膚層をウィンドウクリップで固定してマウスを閉鎖します。マウスをケージに戻し、経過を観察します。回復のため、マウスの飲用水として酢酸水を供給してください。分離したCマウスのアイレットを、本ビデオで説明した方法を用いて、同種C 57 black sixマウスに治療量移植しました。術後1日目より、非空腹時血糖値をモニタリングしました。同種ドナーから300個のアイレットを移植した20gのレシピエントマウスでは、17日目付近で拒絶反応が認められます。同系ドナーから150個または300個のアイレットを移植したマウスにおいて、回復状況のモニタリングを行いました。これらの移植では、アイレットが同系ドナー由来であるため、拒絶反応は見られません。投与されたアイレットの用量は、移植直後のアイレットの主要な機能を測定する指標となります。150個のアイレットでは不十分な回復しか見られませんでしたが、300個のアイレットを移植した場合には完全な回復が認められました。このビデオを視聴することで、マウスアイレットを単離し、それらを腎臓の被膜下腔に移植するために必要な重要な手順を適切に実行する方法を十分に理解できるはずです。練習を重ねることで、本プロトコルで最も困難な工程である総胆管へのカニューレ挿入を迅速に行えるようになります。

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JoVE Journal

Medicine

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