マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

アイレット移植は、1型糖尿病の潜在的な治療法として提案されています。しかし、2つの大きな制限が、それが広範な臨床的現実であることを妨げています。まず、受信者ごとに多数のアイレットが必要です。

アイレットは臓器提供者から得られるため、レシピエント候補の数は厳しく制限されています。2回目の移植では、強力な免疫抑制剤による生涯にわたる治療が必要であり、患者、特に小児集団は悪性腫瘍、感染症、腎不全のリスクにさらされます。マウス腎臓嚢下へのアイレット移植は、臨床移植の転帰を改善するための戦略を検討するために行われます。

健康なドナーマウスから分離されたアイレットをグループに分け、移植の準備をしました。次に、アイレットを腎臓の被膜下腔に移植します。糖尿病のレシピエントマウスでは、アイレット移植機能は血糖値を監視することによって評価され、移植後24時間以内に約250〜350個のアイレットが20グラムのレシピエントマウスのu血糖を回復させることが明らかになります。

この方法を視覚的に示し、カニューレ挿入の手順を考えることが重要です。総胆管とアイレットの腎臓の被膜下腔への移動は習得が困難です。これらのステップでは、組織構造の特定、安定した手、および組織の損傷を最小限に抑える技術の使用が必要です。

安楽死させたマウスを解剖スコープのペーパータオルの上に仰臥位に置き、腹部に70%エタノールをスプレーします。はさみを使用して、恥骨領域から両前脚へのV字切開で腹部を開きます。マウスは解剖範囲の下にあります。

頭を観測者に向けて配置します。総胆管の十二指腸入口を止血クランプで特定し、総胆管の十二指腸開口部を特定します。止血剤は、圧縮したときに膵臓の腸の境界に沿って正確に走るように配置する必要があります。

ここでは、胆管をカニューレ挿入する 2 つの方法を示します。フリーハンド法と鉗子補助法で胆管をカニューレ状にする方法。フリーハンド法を使用して、十二指腸に固定された止血剤をマウスの頭から尾に向かって引き離し、総胆管がぴんと張るようにします。

肝臓に近い胆管には合流点があり、胆嚢からの胆汁排出と肝臓からの酵素が一緒になります腸に入る前に、胆管をしっかりと引っ張ってVポジションの内側を露出させます。5ミリリットルの注射器に取り付けられた曲がった27ゲージの針で、針がV字を通り抜けて直接ダクトの下部にカニューレを通します。針を斜角の端から数ミリメートルスライドさせて、肝臓と胆嚢への逆流を防ぎます。

カニューレ挿入が成功したら、シリンジから2ミリリットルのリアーゼを分注して膵臓を灌流します。最適なカニューレ挿入の指標として、胃の上での膵臓の拡大に注意してください。あるいは、胆管をカニューレで挿入することもできます。

鉗子嚢胞法を使用する。十二指腸に固定された止血剤Cをマウスの頭から尾に向かって引き離し、総胆管が不法行為になるようにします。次に、5ミリリットルの注射器に取り付けられた曲がった27ゲージの針を使用して、肝臓に近い総胆管の下の筋膜に穴を開けます。

針を使用して、針を所定の位置に保持したまま、筋膜をダクトから取り除きます。止血器を下に置き、鉗子を手に取ります。開いた鉗子の片方のアームを使用して、針が筋膜をクリアした胆管を支え、管と鉗子を前方に引っ張ります。

鉗子をバックストップとして使用して、針をダクトにスライドさせます。カニューレ挿入が成功すると、胃の上の膵臓領域が均一に拡張されます。膵臓が灌流されたら、十二指腸から止血剤を取り出します。

次に、鉗子を使用して十二指腸を持ち上げ、2番目の鉗子のペアを使用して膵臓を腸から分離します。次に、胃の上部と脾臓から膵臓を引き抜きます。最後に、膵臓を腹部から持ち上げ、腸、胃、脾臓への残りの筋膜接続から膵臓を切り取ります。

膵臓を50ミリリットルの円錐形のチューブに入れ、氷の上に置きます。付属の書面によるプロトコルの指示に従って、膵臓を摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、チューブに20ミリリットルの培地を加え、チューブを10秒間に40回激しく振って組織を解離します。

このステップは、スミレの最適な回収に不可欠です。スピンセルは毎分800回転です。Resusは15ミリリットルの培地に費やし、サンプルを凝縮します。

再懸濁したスラリーを0.419ミリメートルの金網に注ぎ、新しい50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎます。10%の胎児ウシ血清を含む培地の追加10ミリリットルで最初のチューブをすすぎ、遠心分離reusによって細胞を金網ペレットを通して注ぎ、室温の5ミリリットルでペレットを曲げます彼の不透明な10 77。その後、数秒間穏やかに渦巻かせ、チューブの内側の周りに彼の不透明な5ミリリットルを追加して、チューブの壁からアイレットを洗い流し、ゆっくりとピペットで10秒あたり1ミリリットルの割合でチューブの側面に10ミリリットルの血清を含まないRPMIをオーバーレイします。

シャープなインターフェースが明らかになるはずです。次に、スイングバケット遠心分離機で摂氏20度、重力900倍で20分間、非常にゆっくりと加速し、遠心分離後のブレーキなしでサンプルを回転させ、膵島は使い捨ての10ミリリットル血清ピペットを使用して外分泌細胞から分離されます。histo Paqueメディアインターフェースからアイレットを新しい50ミリリットルの円錐管に移します。

この時点でいくつかのチューブをプールしてアイレットの残留物を除去することができ、彼の不透明な充填チューブに血清を含むチューブを充填し、毎分800回転でチューブを2分間遠心分離することにより、膵島をペレット化します。次に、reusは新しいメディアで島を一時停止します。この手順を少なくとも 2 回繰り返します。レウス。

パレットを5ミリリットルのメディアに吊り下げます。0.1ミリメートルのナイロンセルストレーナーを逆さまにして、15ミリリットルの円錐形チューブに置きます。再懸濁した細胞スラリーをピペットで通し、アイレットを収集します。

次に、50ミリリットルのチューブを追加の6ミリリットルのメディアですすぎ、ストレーナーに通します。10センチのペトリ皿に3ミリリットルのメディウムを滴下します。セルストレーナーを反転させ、培地ドロップに浸してアイレットを収集し、ストレーナーを介してさらに5〜7ミリリットルの培養培地をペトリ皿にピペットで取り込みます。

ストレーナから残っているアイレットを4倍の目的の下で収集するには、P 200ピペットでアイレットを個別に選択し、1.5ミリリットルのマイクロフージチューブに移します。これらの画像は、12週齢のC 57 black sixマウスから分離されたアイレットを示しています。アイレットの純度と品質は、分離手順の完了時に顕微鏡で推定できます。

例えば、ここに示す2つの画像は、破片と外分泌細胞の汚染が存在する代表的なフィールドを示しています。実験のためにアイレットを選ぶときは、汚染された外分泌細胞や健康でないと思われるアイレットを選ぶことは避けてください。壊死中心を持つアイレットは、この図に示すように、隔離後24時間で撮影されたため、隔離直後に壊死中心は見えません。

細胞が脱落しているアイレットは避けられず、このアイレットの24時間タイムラプス動画でアイレット移植に使用することができます。単離直後、多くのアイレット内に壊死性中心が発達します。これらの壊死中心は、アイレットをピッキングしている間、記録の終わり近くでアイレットから排出されるように見えます。

各チューブがアイレットの品質とサイズが均等に分布するようにグループ化します。たとえば、15 個のアイレットの各グループには、4 つの大きなサイズのアイレット、6 つの中型のアイレット、5 つの小さなアイレットが含まれる場合があります。場所。アイスアイレットのチューブは、移植にすぐに使用したり、操作したりできます。

使用する前に。1.5ミリリットルのマイクロフューズドチューブの開口部に滅菌ゲルローディングチップを配置し、緩やかに曲がるようにして、チップの狭い端にU字型を作ります。先端の両方の開口部は、マイクロゴミチューブの真上を向いている必要があります。

アイレットのチューブを氷からそっと取り外します。すべてのアイレットがチューブの底に落ち着いていることを確認します。P 200ピペットを使用して、チューブの底からアイレットを最小限の容量でそっと集め、準備した湾曲した先端に移します。

アイレットが沈殿した後、アイレット担持ゲルローディングチップの大きな開口部を通して培地を吸引することにより、チップからできるだけ多くの培地を除去する新しいゲルローディングチップをP 200ピペットに取り付けた。チューブの斜めになっていない端を、膵島ベアリングゲルローディングチップの狭い開口部に取り付けます。次に、チップをP 200ピペットに取り付け、膵島をチューブにそっと押し込みます。

次に、PE 50チューブの斜めのないエッジを25マイクロリットルのハミルトンシリンジの針に接続します。プランジャーを引き出した状態で、アイレットが斜めの開口部から約0.5センチメートル離れるまでシリンジのプランジャーを押します。腎臓がアイレットを受け取る準備をしている間、アイレットがチューブの斜めの開口部の近くに単一の塊に落ち着くように、シリンジを脇に置きます。.

髪を切り取り、ベタジンと70%イソプロピルアルコールを交互に3回交互に皮膚をこすり洗いして、手術部位を準備します。アイレット移植の手順は、レシピエントマウスの麻酔を確認するためにつま先をつまむことから始まります。ガラス棒のシャフトをマウスの真下、脊髄に垂直な腎臓の下に置きます。

次に、皮膚を通して腎臓の位置を特定し、滅菌済みの外科用ドレープを配置します。腎臓の位置が特定されたら、マクファーソンバニスハサミを使用して、脊髄に垂直に真皮の真皮を2センチメートル切開します。この切開は、はさみで腹膜壁を露出させます。

ガラス棒のシャフトをバックストップとして使用して、真皮層を切るのと同じ方向に腹壁を1センチメートル切開し、隣接する表面を押し下げて腎臓を腹膜開口部に押し込みます。露出した腎臓の表面を、浸した綿の先端のアプリケーターを使用して、氷のように冷たく滅菌されたPBSで濡らします。腎臓嚢が乾燥するのを防ぐために、必要に応じて数分ごとに手順を繰り返します。

27ゲージの針を使用して、腎臓の前面を横切って腎臓嚢を通して0.2センチメートルの切開を行います。左側面から右側に向かって、炎を引っ張ったガラス毛細管を挿入します。以前に行った切開部をプローブし、腎臓の背側側面に沿って後方向に動かします。

腎臓嚢と腎臓実質の間に袋を作るには、準備した25ミリリットルのハミルトンシリンジのアイレットを、フレキシブルチューブの斜めの開口部の端まで動かします。次に、上を向いて面取りされたエッジを被膜下ポーチに挿入します。長辺は腎臓実質と接触しています。

チューブをカプセルの最も後端に移動します。.次に、シリンジのプランジャーを押し下げて、アイレットをPE 50チューブから嚢下ポーチにゆっくりと移します。アイレットがポーチを満たしたら、フレキシブルチューブをゆっくりと戻し、スペースを増やします。

ポーチからチューブを取り出した後、ガラスプローブを腎臓の外面に沿って前方から後方にスライドさせ、アイレットをポーチの近位端にそっと詰めます。曲がった腕の鉗子を使用して、腎臓用に作られた開口部に隣接する腹膜を持ち上げます。次に、PBSに浸した綿の先端のアプリケーターを使用して、腎臓を腹腔にそっと押し戻します。

腹膜壁に縫合糸を、真皮層に創傷クリップを適用してマウスを閉じます。マウスをケージとモニターに戻します。回復のためには、マウスの腸にアセトマイネ水を提供する必要があります。.

Cマウスアイレットを分離。このビデオに記載されている方法を用いて、同種C 57黒色6匹マウスに根治用量を移植した。非空腹時血糖値は、術後 1 日目から監視されました。

拒絶反応は、同種ドナーから300個のアイレットを受け取った20グラムのレシピエントマウスで17日目頃に見られます。回復は、同系ドナーから150個のアイレットまたは300個のアイレットを投与されたマウスでモニターされました。この移植では、アイレットが同系ドナーからのものであるため、拒絶反応は見られません。

投与されたアイレット用量は、移植直後のアイレットの主要な機能を測定します。150個のアイレットでわずかな回復が見られましたが、300個のアイレットを移植したときには完全な回復が見られました。このビデオを見れば、マウスのアイレットを分離し、それらのアイレットを腎臓の被膜下腔の下に移植するために必要な重要な手順を実行する方法について十分に理解できるはずです。

練習を重ねることで、このプロトコルの最も難しいステップである総胆管に素早くカニューレ挿入する能力を身につけることができます。